Індукція прискореного атеросклерозу у мишей Протокол зразкової травми (переклад на

Резюме

Це дослідження описує інвазивний метод індукування прискореного атеросклерозу у мишей. У порівнянні з іншими методами, що використовують електричні або криоіндуковані травми, механічно індукована травма імітує стан рестенозу людини після терапії реваскуляризацією та ідеально підходить для вивчення задіяних молекулярних механізмів.

Анотація

Атеросклероз - це проліферативне фіброзно-запальне захворювання, яке розвивається в артеріальній стінці і викликає дефіцит кровотоку або дефіцит кровотоку. Крім того, артеріосклероз індукує утворення оклюзійного тромбу через розрив дефектної стінки судини, що є основною причиною інфаркту міокарда або інсульту та найпоширенішою причиною смерті. Незважаючи на досягнення в області серцево-судинної системи, багато питань залишаються без відповіді, і додаткові фундаментальні дослідження є важливими для покращення нашого розуміння молекулярних механізмів, пов'язаних з атеросклерозом, та його наслідків. Через обмежені клінічні дослідження необхідні репрезентативні моделі на тваринах, які імітують атеросклеротичні захворювання, такі як формування неоінтима після імплантації стента, балонна ангіопластика або ендартеректомія. Оскільки миша має багато переваг і є найбільш широко використовуваною моделлю для вивчення молекулярних процесів, сучасне дослідження пропонує інвазивний метод денудації ендотелію, також відомий як модель пошкодження дроту, який є репрезентативним для стану людини утворення неоінтіми в артеріях після процедур реваскуляризації є.

Вступ

Основним недоліком моделі миші є невеликий розмір основних артерій, що піддаються атеросклеротичному захворюванню (сонної артерії, аорти та стегнової артерії), що вимагає кваліфікованих хірургічних знань та навичок для маніпулювання судинами та інвазивної індукції атеросклеротичного нальоту. Тому модель прискореного утворення неоінтіми, запропонована в цій роботі, в контексті рестенозу після ендартеректомії або встановлення стента представлена покроковими рекомендаціями та пропозиціями для полегшення введення зацікавленому персоналу. Іншим недоліком є те, що денудація відбувається на нормальній артеріальній стінці, і тому утворення неоінтими буде помірним порівняно з клінічною ситуацією. Високий рівень холестерину в плазмі крові, досягнутий у мишей Аполіпопротеїн Е-нокаут (Apoe -/-), які харчуються дієтою з високим вмістом жиру, створює належне прозапальне середовище, необхідне для формування неоінтими.

Операція проводиться під стереомікроскопом. Сонна артерія оголюється через серединний розріз у передній частині шийки матки. Анатомічні структури на сонній артерії та навколо неї мінімально маніпулюють, щоб зменшити післяопераційне запалення. Біфуркація сонної артерії призупинена. Для того, щоб викликати прискорене утворення неоінтіми, внутрішні та зовнішні сонні артерії готуються до перехоплення потоку та подальшої частої відмови сонної артерії. Підводячи підсумок, методиці можуть навчитися співробітники, які мають мінімальний досвід роботи на хірургії тварин.

Протокол

Експерименти, представлені в цій роботі, проводяться відповідно до німецького законодавства та європейських рекомендацій щодо догляду за тваринами. Тварини утримуються в приміщенні для тварин Інституту лабораторних наук про тварин Університетської клініки Аахена під керівництвом проф. Р. Толба та д-р. А. Тобнер (вихователь з питань захисту тварин).

Тримайте мишей у спеціалізованому прийомному відділенні для забезпечення належного доступу до їжі та спеціалізованого ветеринарного контролю та лікування. Якщо тварин переміщує або купує третя сторона, будь ласка, забезпечте тижневий термін утримання перед тим, як пройти процедуру.

6 - 8 тижнів, корм 18 - 20 г, самки (за бажанням) ApoE -/- миші з атерогенною дієтою (21% жиру, 0,15% холестерину, 19,5% казеїну, мас./Мас.) За тиждень до хірургічне втручання та продовжувати дієту, поки не буде зроблений аналіз атеросклеротичного нальоту.

3. Хірургічна підготовка

Зніміть ретрактори і поверніть м’язовий шар і два жирових тіла у фізіологічне положення.
Закрийте шкіру трьома окремими швами 0/6, якщо потрібні ехокардіографічні вимірювання. Якщо візуалізація не потрібна, використовуйте металеві затискачі, щоб закрити шкіру.
Помістіть мишу під інфрачервоне світло зліва, поки вона не прокинеться. Не залишайте тварину без нагляду або з іншими тваринами, поки вона повністю не відновиться.
Виділіть мишу для подальшої ідентифікації з локальною системою. Запитайте співробітника з питань захисту тварин у місцевому закладі.

6. Аналіз атеросклеротичного нальоту

Репрезентативні результати

Процедура індукції атеросклеротичного нальоту триває 15-20 хвилин і демонструє мінімальну смертність, головним чином через кровотечу, яка виникає під час процедури. Після операції миші відновлюються від наркозу протягом 20-25 хвилин. Після операції не спостерігалося фізичних порушень, таких як параліч або порушення харчування.

Пошкодження дроту індукує деендотеліалізацію, яка імітує ураження судин після видалення балона або імплантації стента. Одразу після пошкодження оголена судинна стінка буде покрита шаром тромбоцитів, який опосередковує та сприяє адгезії моноцитів 12. Активовані клітини гладких м’язів із середовища розмножуються і мігрують в інтимні простори, що утворюють неоінтиму. Інші попередники гладком'язових клітин мігрують з крові (приблизно 40%) і сприяють новоутворення. Формування нальоту закінчується після повної ре-ендотеліалізації, як правило, через 4 тижні після пошкодження дроту.

Утворення неоінтіми можна оцінити за допомогою фарбування Мовата. Розмір нальоту розраховується для кожного слайда за допомогою програмного забезпечення, як у Малюнок 2Bпоказано. Загальний розмір зубного нальоту (ліва сонна артерія) може коливатися від 70 000 до 100 000 м2, тоді як розмір контрольного посудини (права сонна артерія) може варіюватися від 7 000 до 8 000 м2. Ці значення багато в чому залежать від хірурга. Тому ми настійно рекомендуємо використовувати одного і того ж хірурга для одного і того ж дослідження протягом усіх експериментів.

Розроблений наліт нагадує рестеноз стента, який складається переважно з реплікованих та мігруючих гладком’язових клітин із середовища. у стенті Клітинний склад, визначений імунологічним фарбуванням, показує, що вміст гладком'язових клітин становить близько 30-40%, тоді як макрофаги виявляються в 15-25% неоінтіми пошкодженої судини. Реендотеліалізацію можна виміряти після фарбування ендотеліального маркера і розрахувати як відсоток окружності, забарвленої по всій окружності просвіту. Як правило, повторна ендотелізація досягає 80 - 90% через 3 тижні і повинна бути майже повною через 4 тижні (Малюнок 2С). Щоб слідкувати за зростанням нальоту в міру його розвитку, один і той же аналіз можна повторити для кожного моменту часу після пошкодження дроту, залежно від зацікавленості та вивченої теми (див. Таблиця 1).

ілюстрація 1. Схематичне зображення оперативної процедури. (A) Розміщення операційного столу щодо оператора під час процедури пошкодження дроту(B) Збільшений вигляд загальної сонної артерії та її гілок, як це видно під мікроскопом при збільшенні в 10 разів(C) з'являється.D) Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Малюнок 2. Аналіз рестенозного нальоту. (A) Схематичне зображення аналізу нальоту в загальній сонній артерії через 4 тижні після індукції пошкодження дроту(B) Формування Neointima через 4 тижні після пошкодження дроту та схематичне зображення найважливіших параметрів, що використовуються для аналізу. Інтима (зелена зона) - це різниця між просвітом (червоним) та внутрішнім шаром пластинки (зелена лінія). Медіа (жовта область) - це різниця між зовнішньою пластинкою (жовта лінія) та міжнародною (зелена лінія). Шкала масштабу 100 м(C) Репрезентативні зображення фарбування найважливіших типів клітин, що беруть участь у формуванні неоінтіми. Клітини гладких м’язів (актин гладких м’язів - червоний, шкала шкали 100 м), макрофаги (Mac 2 зелений, шкала шкали 100 м) та ендотеліальні клітини (CD31 - червоний, стрілки, шкала шкали 50 м). Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Обговорення

У цьому дописі ми надаємо корисні поради щодо проведення процедури пошкодження дроту навіть працівниками, які мають мінімальний досвід роботи на хірургії тварин. Існує два найважливіші етапи виконання цієї процедури: надріз зовнішньої сонної артерії та введення дроту. Розріз зовнішньої сонної артерії повинен бути зроблений якомога далі від біфуркації, щоб забезпечити достатній залишковий матеріал (Малюнок 1С). Розріз не повинен бути занадто великим, оскільки існує ризик порізати весь посудину. Другим критичним етапом є високий ризик кровотечі під час артеріотомії та введення направляючого проводу, якщо кровотік не контролюється ефективно. Крім того, якщо направляюча дріт неправильно вставлена в судину просвіту, денудація ендотелію або розрив артерії не можуть відбутися. Щоб цього уникнути, перед роботою поверхню напрямного дроту необхідно ретельно відполірувати.

Для оптимізації протоколу положення операційного столу з головою миші у напрямку хірурга забезпечує кращу видимість, доступність та контроль для правильної маніпуляції з провідним дротом. Крім того, щоб збільшити відтворюваність, використовуйте один і той же провідник у всіх дослідженнях. Оскільки розмір дроту не змінюється, важливо врахувати та усунути всі можливі відмінності між мишами, використовуючи одну і ту ж стать, вік та вагу для всіх мишей, включених у дослідження. Після цього Еванс-Блю допоможе хірургу визначити ефективність денудації. Наявність відповідного обладнання є необхідною умовою успішності процедури. Для виконання цієї процедури необхідний 10-кратний стереомікроскоп. Правильна підготовка напрямного дроту (наприклад, полірування) має вирішальне значення. Тому ми настійно рекомендуємо проводити підготовку дроту спеціалізованим технічним персоналом, якщо такий є.

Цей журнал містить багато кроків з усунення несправностей. Якщо ви порізали зовнішню сонну артерію поблизу біфуркації, обережно зав'яжіть зовнішні частини біля біфуркації, щоб не виникало кровотечі. Зовнішню сонну артерію під час різання не видно. Тому розглянемо роздвоєння на рівні шовкового шва. Збирайте ділянки, коли шовковий шов зникає. Якщо розріз на зовнішній сонній артерії занадто великий, а судина зламана, переконайтеся, що кровотік в сонній комунісі та внутрішній сонній артерії ефективно відрізати, і спробуйте знайти отвір судини за допомогою щипців. Після введення і денудації провідного дроту прив’яжіть посудину біля біфуркації. Під час різання починайте збирати, коли шов почне зникати зі шва. Якщо під час денудації провідним проводом відбувається розрив артерії, перевірте під мікроскопом, чи правильно відшліфована направляюча дріт.

Незважаючи на подібність моделі пошкодження дроту до клінічних ситуацій, багато груп зосереджуються на корінному атеросклерозі мишей або обирають інвазивні індукції атеросклерозу, такі як балонна ангіопластика у щурів або кроликів, через відсутність навченого персоналу, здатного виконувати дрібні операції на тваринах. Незважаючи на переваги використання кроликів/щурів, напр. Наприклад, без мініатюризованого обладнання ні моделі щурів, ні кроликів не пропонують широкий спектр різних нокаутуючих штамів для вивчення молекулярних механізмів, що беруть участь у зростанні новоутворення та тромбозі в стенті.

Денудація проводиться на нормальній артеріальній стінці, хоча і з атеросклеротичним фоном. Тому утворення неоінтіми буде помірним порівняно з клінічною ситуацією. Велика кількість доклінічних моделей показує, що жодна з моделей не відповідає всім критеріям, необхідним для розкриття сукупності клітинних і молекулярних механізмів, що призводять до патофізіології у людей (див. Таблиця 2).

Після завершення процедури пошкодження дроту можуть бути проведені інші біологічні та молекулярні аналізи для ідентифікації клітин, білків, мРНК, мікроРНК, генів або інших біомаркерів, які можуть бути використані як терапевтичні мішені для розробки нових стратегій лікування атеросклерозу, особливо для формування неоінтіми після пошкодження судин. . За наявності зростання нальоту можна контролювати за допомогою високочастотного ультразвуку або інших методів візуалізації з високою роздільною здатністю. Крім того, оволодіння цією технікою дозволить оператору адаптувати протокол до інших моделей інвазивного індукції атеросклерозу, таких як: B. Розміщення коміра, часткове перев’язування або навіть імплантація стента.