Індукція запалення кишкового миша шляхом адаптивного перенесення ефекту CD4 CD45RBighgh Т-клітин

Анотація

Існує багато різних тваринних моделей для вивчення патогенезу запальних захворювань кишечника людини (ВЗК), кожна з яких має свої переваги та недоліки. Ми описуємо тут експериментальну модель коліту, яка ініціюється переносним перенесенням сингенної селезінки CD4 + CD45RB з високими Т-клітинами в реципієнтів мишей з дефіцитом Т і В-клітин. Популяція CD4 + CD45RB з високим вмістом Т-клітин, переважно складена з наївних ефекторних клітин, може індукувати хронічне запалення кишечника, дуже подібне до важливих аспектів IBD людини. Цією процедурою можна маніпулювати для вивчення аспектів початку та прогресування захворювання. Крім того, його можна використовувати для вивчення функції вроджених, адаптивних та регуляторних популяцій імунних клітин, а також ролі факторів навколишнього середовища, тобто мікрофлори при запаленні кишечника. У цій статті ми пояснимо метод індукування коліту за допомогою поетапного протоколу. Це включає відеодемонстрацію ключових технічних аспектів, необхідних для успішної розробки цієї моделі миші експериментального коліту для дослідницьких цілей.

Протокол

ПРИМІТКА: Переконайтесь, що всі протоколи тварин затверджені та відповідають положенням Інституційного комітету з догляду та використання тварин (IACUC) та Посібнику Національної дослідницької ради з догляду та використання лабораторних тварин. Миші-донори можуть бути як самцями, так і самками, але миші-реципієнти повинні бути самцями. Якщо будуть використовуватися жінки-реципієнти, мишами-донорами повинні бути жінки 5. Регулярно утримуйте колонії, використовуючи нестерильні грядки та некислу воду, оскільки вони впливають на кишкову флору і, отже, фенотип коліту мишей 5,6.

  1. Використовуйте крижані середовища та буфери. Під час експерименту тримайте клітини на льоду.
  2. Проведіть експеримент у стерильній витяжці з біологічною небезпекою за стерильною технологією.

2. Виділення Т-клітин селезінки

3. Збагачення CD4 + Т-клітин

Примітка: Дотримуйтесь інструкцій виробника щодо конкретних продуктів, що використовуються в цьому розділі.

4. Маркування та сортування комірок 7

миша
Рисунок 1: Репрезентативні ділянки потокової цитометрії популяцій CD4 + CD45RB Т-клітин під час аналізу FACS (А. - В) FITC CD4- та PE CD45RB-забарвлені спленоцити від донорських мишей C57BL/6 були відсортовані за допомогою FACS на CD4 + CD45RB high та CD4 +. CD45RB низькі Т-клітинні популяції. (A) Події дублету, виключені на фронт-сюжеті. (B) Лімфоцити були відтворені на графіках розсіювання вперед та побічно. (C) CD4 + Т-клітини були закритими, і (D) CD4 + CD45RB + Т-клітини наносили на графік PE порівняно з гістограмою подій. Низькі клітини CD4 + CD45RB вважалися найнижчими 20% клітин CD45RB +. Високі клітини CD4 + CD45RB були визначені як найвищі 40% клітин CD45RB +.

  1. Запустіть аліквоту кожної популяції клітин на машині FACS, щоб оцінити чистоту популяції.
  2. Клітини центрифуги розміром 450 г протягом 7 хв, ресуспендуючи в 1 мл PBS. Видаліть аліквоти клітин для підрахунку та оцінки життєздатності клітин шляхом виключення трипанового синього, як на кроці 2.9.

5. Ін’єкція клітин реципієнтам

  1. Ресуспендуйте відсортовані клітини до 4 х 106 клітин/мл (високий CD45RB) або 2 x 106 клітин/мл (низький CD45RB) у PBS.
  2. Перенесіть 100 мкл клітин з високим вмістом CD45RB на одержувача в нові стерильні пробірки. Додайте до цієї пробірки 100 мкл PBS на одержувача. Загальна кількість ін’єкцій на одну тварину становить 200 мкл, а загальна кількість клітин на реципієнта - 4 × 10 5 CD4 + CD45RB високонаївних Т-клітин.
  3. Якщо бажана експериментальна група, що містить регуляторні Т-клітини, додайте 100 мкл клітин CD45RB на реципієнта в нові стерильні пробірки. 100 мкл CD45RB низьких клітин на реципієнта в одній пробірці. Загальна кількість ін’єкції на тварину становить 200 мкл; Співвідношення високого CD45RB: низьких клітин CD45RB становить 2: 1.
  4. Введіть 100 мкл CD45RB високого або CD45RB високого/низького CD45RB CD4 + клітин внутрішньочеревно в праву та ліву сторони живота (загалом 200 мкл) кожного реципієнта.

6. Моніторинг прогресування захворювання у тварин-реципієнтів

  1. Для оцінки клінічного стану тварин-реципієнтів загальні клінічні оцінки за наступними параметрами призначають 8 у день ін’єкції, щотижня після цього та при жертві:
    1. Визначте марнотратство, вимірюючи втрату ваги: ​​0 - відсутність втрати ваги; 1 - 0,1 - 10% втрата вихідної маси тіла; 2 - втрата понад 10% вихідної маси тіла (Малюнок 2А).

запалення
Рисунок 2: Клінічні та патологічні ознаки запалення після перенесення диких типів CD4 + CD45RB із високими Т-клітинами спостерігаються у мишей-реципієнтів Rag1 -/- та NRDKO 11 (A) Реципієнти NRDKO втратили в середньому 10% від початкової маси тіла 5. Тижні після передачі, тоді як Rag1/реципієнти на той момент не мають клінічних ознак захворювання. Кожна точка представляє середній відсоток початкової маси тіла для когорти ± SEM. ** Миші-реципієнти P -/- та NRDKO потовщені та вкорочені порівняно з товстою кишкою мишей Rag1 -/- та NRDKO без адаптивного перенесення Т-клітин. Товста кишка мишей-реципієнтів NRDKO демонструє сильне запалення та підвищене ожиріння (дані не наведені). Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Приблизно 10 x 10 6 CD4 + CD45RB високих Т-клітин з 10 селезінок дорослих мишей-донорів C57BL/6 надійно виділені. Ця кількість буде змінюватися залежно від віку та штаму миші-донора та майстерності дослідника. Коли 4 x 10 5 C57BL/6 CD4 + CD45RB високі Т-клітини переносяться в мишей-реципієнтів C57BL/6 Rag1 -/-, клінічні ознаки захворювання виникають приблизно через 5 тижнів після насичення або раніше, якщо миші генетично схильні до більш важкого захворювання ( Малюнок 2, 3) 11.12. CD3 + Т-клітини можна побачити в товстій кишці у реципієнта Rag1 -/- вже через 3 тижні (3А) 12-й.

шляхом
Рисунок 3: Передача дикого типу CD4 + Високі Т-клітини CD45RB у реципієнтів Rag1 -/- та RKO/δ KD індукують хронічне запалення кишечника 12 (A) (Оригінальне збільшення 10X, H&E та CD3 Імуногістохімія). Фарбування H&E (верхні панелі) показує гіперплазію епітелію, інфільтровані запальні клітини та абсцеси крипт (стрілка), наявні у реципієнта RKO/δ KD, але не у реципієнта Rag1 -/-. Товста кишка мишей-реципієнтів RKO/δ KD продемонструвала значне накопичення CD3 + Т-клітин CD3 IHC (нижні пластини) порівняно з товстою кишкою реципієнтів Rag1 -/-. (B) Товста кишка мишей-реципієнтів RKO/δ KD продемонструвала більш серйозне запалення порівняно з товстою кишкою мишей-реципієнтів Rag1 -/-, як визначено за допомогою гістологічного оцінювання. (C, D) Культури експлантату товстої кишки від мишей-реципієнтів RKO/δ KD секретували менше IL-10 (C) та IL-12p40 (D) ніж зроблено культури експлантації товстої кишки Rag1 -/-. Миші-приймачі натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію зображення.

Раніше ми опублікували, що прийомний перенос Т-клітин у реципієнтів з подвійним нокаутом (NRDKO) розвиває важкий коліт порівняно з мишами-реципієнтами Rag1 -/- (Малюнок 2) 11. NFIL3 негативно регулює IL-12p40 у мишачих макрофагах товстої кишки незалежно від його IL-10-індукуючого ефекту 13. Дисрегуляція IL-12p40 та IL-10 є в патогенезі IBD людини 1. Таким чином, неконтрольоване вироблення IL-12p40 при адоптивному перенесенні Миші-реципієнти NDRKO спричиняють більш швидке прогресування захворювання, наприклад, втрату ваги (2А) показано. Деякі миші-реципієнти NRDKO отримали серйозне захворювання, що призвело до випадання кишечника (2 Б). Грубі товсті кишки мишей-реципієнтів NRDKO потовщені та вкорочені, що призводить до значної імміграції запальних клітин у товсту кишку порівняно з мишами-реципієнтами Rag1 -/- (2С).

Порівняно у мишей Rag1 -/- з нефункціональною каталітичною одиницею p110 δ PI3K у нелімфоцитарних популяціях (RKO/δ KD) CD4 + CD45RB високі Т-клітини викликали такий же швидкий і серйозний клінічний перебіг захворювання порівняно з переповненням Миші NRDKO (3) 12. Гістологічний аналіз через 3 тижні показує гіпертрофію тканин товстої кишки, запалення, інфільтрати клітин Торі та абсцеси крипти (стрілка) у реципієнта RKO/δ KD порівняно з реципієнтом Rag1 -/- (3А). Миші-одержувачі в цьому експерименті були евтаназовані протягом 3 тижнів через значну кількість, яка втратила 20% від початкової ваги. Гістологічні показники, як патологічно засліплені для досліджуваних груп і визначені на основі конкретних критеріїв, розроблених у нашій лабораторії 12, порівняно з Rag1 були вищими у мишей-реципієнтів RKO/δ KD -/- реципієнтних мишей (3B). Крім того, спонтанне вироблення цитокінів із культур експлантату товстої кишки показало зниження продукування IL-10 та IL-12p40 мишами-реципієнтами RKO/δ KD порівняно з мишами-реципієнтами Rag1 -/- (3C, D) 12. Знову ж таки, збільшення IL-12p40 і зменшення продукування IL-10, причетні до патогенезу IBD людини 1.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Тут ми описуємо покроковий протокол індукування запалення товстої кишки у мишей шляхом адоптивного перенесення CD4 + CD45RB + Т-клітин у імунодефіцитних мишей. Ми використовували донорську селезінку C57BL/6 та сингенних мишей-реципієнтів Rag1 -/-, хоча інші штами (наприклад, BALB/c, 129S6/SvEv, діабетик, що не страждає ожирінням (NOD)) та генетичні моделі імунодефіциту (наприклад, SCID, Rag2 -/- ), також може використовуватися 4,14-16. Добре відомо, що фоновий штам впливає на тяжкість експериментального коліту у мишей 1. Крім того, кишкова мікрофлора у популяції мишей суттєво різниться між установами, в тому числі між тими, хто знаходиться в тій же установі 6,17. Поки 2 і 3 не показав розвитку коліту у мишей Rag1 -/- через 4 тижні після перенесення, за нашим досвідом та досвіду інших реципієнтів Rag1 -/-, щоб розвинути клітичну хворобу між 6 та 9 тижнями після перенесення CD4 + CD45RB з високим -T -Клітини 18-23. Ця мінливість у клінічному перебігу та вираженні хвороби повинна бути якомога нижчою при встановленні цієї моделі експериментального коліту на внутрішньо- та міжекспериментальну невідповідність.

Етапи протоколу, що вимагають оптимізації, - це Розділ 3: Збагачення CD4 + Т-клітин та Розділ 4: Позначення та сортування клітин. Оптимізація збагачення CD4 + Т-клітин залежить від використовуваної магнітної системи і повинна відповідати інструкціям виробника. Параметри системи магнітного розділення комірок наведені в Таблиця конкретних реагентів/аксесуарів перераховані. Бажано збагачувати CD4 + Т-клітини негативним відбором, оскільки пряме мічення цієї популяції може впливати на фенотип клітин. Існує багато клонів антитіл для маркування клітин для FACS. Концентрацію антитіл (етап 4.4) слід оптимізувати для забезпечення специфічного фарбування та адекватного відокремлення популяцій CD4 + CD45RB Т-клітин під час FACS.

Тут ми описуємо методологію добре охарактеризованої моделі адаптивного перенесення мишей хронічного запалення тонкої кишки та товстої кишки, що нагадує IBD 5 людини. Цей покроковий протокол містить ключові методи успішної розробки цих процедур для дослідницьких цілей. Це особливо корисна тваринна модель ВЗК людини, оскільки вона дозволяє синхронізувати захворювання та маніпулювати різними популяціями клітин. Однак миші-реципієнти з ослабленим імунітетом генетично модифіковані без розвитку зрілих адаптивних імунних клітин, які, ймовірно, можуть впливати на подальші процеси захворювання. Незважаючи на це, описаний тут метод виявиться дуже корисним у майбутніх дослідженнях, що визначають вплив кишкової мікрофлори, вроджених клітин імунної системи та адаптивних імунних регуляторних клітин у патогенезі ВЗК людини.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Подяка

Цю роботу підтримали Американське товариство гастроентерологів (AGA) Премія вчених-науковців та Фонд Крона та Коліта Америки (CCFA) Премія за кар'єрний розвиток (SZS), NIH NIDDK F30 DK089692 (ECS) та Центр біології шлунково-кишкового тракту Університету Північної Кароліни та гранти на захворювання P30 DK34987 (гістологічне ядро). Основна установка потокової цитометрії UNC частково підтримується грантом ядерної підтримки Центру NCI (P30CA016086) в Комплексному онкологічному центрі UNC Lineberger. Ми вдячні Лукасу Б. Борсту з Коледжу ветеринарної медицини Університету Північної Кароліни за допомогу з гістопатологічним аналізом та імуногістохімією.