Індукований пентилентетразолом протокол зразкової миші (переклад на німецьку)

Резюме

Цей протокол описує метод хімічного займання з використанням пентилентетразолу та забезпечує мишачу модель епілепсії. Цей протокол також може бути використаний для дослідження сприйнятливості до індукції судом та патогенезу після епілептичних нападів у мишей.

Анотація

Вступ

Епілепсія - це хронічний неврологічний розлад, який характеризується періодичними нападами і вражає близько 1% людей. Основні механізми епілептогенезу та генерації судом у хворих на епілепсію не можуть бути повністю з’ясовані в клінічних дослідженнях. Тому потрібна відповідна тваринна модель для дослідження епілепсії 1.

Різні тваринні моделі епілепсії використовувались для вивчення фізіології епілепсії та виявлення протиепілептичних препаратів 2, 3. Серед цих моделей фармакологічна індукція нападів є загальним методом створення тварини для вивчення патології епілепсії 4. Цей спосіб недорогий і простий. Електродне освітлення також є загальновживаним методом, але вартість процедури вища, і метод вимагає хірургічних та електричних навичок, щоб викликати повторювані напади 5.

Фармакологічна індукція також є корисною, оскільки час та кількість судом легко контролюються. Генетичні моделі мишей, які демонструють спонтанні напади, також використовуються для вивчення епілепсії. Однак передбачити, коли і як часто будуть виникати напади в цих генетичних моделях, може бути неможливо 6. Система спостереження потрібна для спостереження епілептичної поведінки генетично модифікованих мишей 6.

Судоми часто викликаються одним системним введенням PTZ, і відновлення відбувається дуже швидко, протягом 30 хв 4, 5. Таким чином, кількість припадків у моделі PTZ-займання легше контролювати. Однак моніторинг ЕЕГ показав, що генералізовані стрибки можна спостерігати до 12 год після опосередкованого PTZ нападу 20. Отже, тварини бажано залишатись під спостереженням протягом 24 годин після тонічного або міоклонічного нападу 21 для більш детального аналізу механізмів розпалювання.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

Комітет з догляду та використання тварин у Токійському столичному інституті медичної науки затвердив усі експериментальні процедури. Рекомендуються постнатальні миші 8-16 тижнів. Будь-який штам інбридингу є прийнятним для експерименту. Миші C57BL/6 більш стійкі до PTZ, тоді як миші BALB/c та Swiss Albino більш чутливі до PTZ. У цьому дослідженні використовували C57BL/6. Сприйнятливість до PTZ також залежить від віку миші. Порівняно з молодими мишами, старші миші більш вогнетривкі до PTZ-35. Кількість тварин, що використовуються для цього методу, може змінюватися, але для кожної умови потрібно мінімум 6-10 тварин.

Розчиніть 2 мг/мл PTZ у стерильному 0,9% (мас./Об.) NaCl. Підготуйте PTZ в день використання.

Спостерігайте за поведінкою тварини та фіксуйте результати.
1. Класифікуйте та знімайте епілептичну поведінку, як показано нижче, 38, 39 (Рисунок 1b):
  0: нормальна поведінка, відсутність відхилень.
  1: Іммобілізація, лежачи на животі.
  2: Кивок головою, обличчя, передні ноги або міоклонія Megalosauridae.
  3: безперервна міоклонія всього тіла, міоклонічні ривки, хвіст жорсткий.
  4: виховання дітей, тонічний напад, падіння на бік.
  5: тоніко-клонічний напад, падіння на спину, дикий порив і стрибки.
  6: смерть.
Змініть поведінкові критерії, використовуючи Racine Score 40, залежно від експериментальних умов.

4. Після аналізу судом

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Повторна ін’єкція PTZ викликає збільшення тяжкості нападів. Шість мишей C57BL/6 отримували PTZ, а ще 6 мишей - фізіологічний розчин як контрольну групу. Доза PTZ становила 35 мг/кг і було зроблено 10 ін’єкцій. Оцінка судом поступово зростала під час ін’єкцій PTZ, в той час як при ін’єкціях сольовим розчином не спостерігалося судом та ненормальної поведінки (рис.) були спричинені. ANOVA, що супроводжувався тестом Бонферроні, показав значну різницю між групою, яка отримувала PTZ, та групою, що отримувала сольовий розчин.

Повторний напад сприяє аберрантному формуванню аксональних гілок (мохоподібний паросток волокон) та аномальній міграції зернистих клітин в гіпокампі. Мишей лікували PTZ протягом 25 ін'єкцій (дозу регулювали з 24 мг/кг до 35 мг/кг, щоб зберегти сильний напад у мишей, не викликаючи смерті від важкого нападу). Мозок миші фіксувався через 3 тижні після останньої ін’єкції. Контрольний мозок фіксували перед ін’єкціями PTZ. Зрізи мозку імуно фарбували антисинаптопорином (x 500) та анти-ZnT3 (x 500) антитілами проти мохового паростка клітковини (малюнок 3A) та антитілом проти дублкортину (х 200) для спостереження аномальної міграції гранулятних клітин (рис. 3А). Мшисте волокно проростає в гранульованому клітинному шарі, записані обробленими PTZ дисками (рис. 3А). Клітини новонароджених гранул, імунореактивні щодо подвійного кортину, були розташовані в межах хілусу на зрізах, оброблених PTZ (Рисунок 3А) спостерігається. Гранульований клітинний шар і гілус, показані на малюнку 3А наведено на малюнку 3 bпоказано.

Обговорення

Тут ми представляємо загальнодоступний протокол для встановлення фармакологічної моделі тварин на епілепсію. ПТЗ-опосередковане хімічне займання має давню історію і є загальновизнаною моделлю для вивчення гістопатології та клітинної патології епілепсії 41. Модель хімічного розпалу епілепсії раніше досліджували Суздак та Янсен, 1995 42. Фармакологічна індукція судом, особливо при PTZ, є простим і простим методом для спричинення тяжких нападів. Зміни дози ін’єкції корелюють із тяжкістю судом. Отже, дуже легко визначити відповідну дозу під час численних досліджень, змінивши дозу PTZ та результуючу поведінку.

Багато дослідників намагалися змоделювати мишей, що вбиваються або вбиваються, таких як епілепсія, і досягли успіху у виробленні мишей, які мають спонтанні судоми 43, 44 Однак фармакологічна індукція судом залишається хорошою моделлю для епілепсії. Інший поширений метод індукції судом, який називається генетичною модифікацією, включає імплантацію електродів у мозок тварини та індукцію електрошокових судом. Цей метод є дорогим, складним і вимагає хірургічних навичок імплантації електрода в точному місці мозку 5.

Хімічна індукція судом дозволяє швидко дослідити епілептогенез та протиепілептичний скринінг лікарських засобів за низькою вартістю 2, 4. Частота та тяжкість спонтанних нападів та СЕ різняться залежно від використовуваного препарату. Каїнова кислота та пілокарпін в основному використовуються для провокації ШЕ, а згодом і хронічних спонтанних або повторюваних судом 45, 46, 47. З іншого боку, PTZ використовується як для стимулювання SE, коли ви розвиваєтесь у великій дозі, так і для хімічно запалених тварин, коли їх дають у судомній дозі 48,49. Крім того, відомі механізми судорожних препаратів, що викликають напади. Наприклад, блокування механізму нападу може допомогти визначити протиепілептичні препарати. З іншого боку, генетичні моделі необхідні для вивчення механізмів, що викликають епілептичні напади 50. Після з’ясування механізмів, що викликають напади, можна розпочати скринінг антиепілептичних препаратів.

У репрезентативних результатах, показаних тут, поведінку тварин спостерігали протягом 30 хв після введення PTZ. Однак, як згадано в розділі Протоколу, поведінку тварин переважно спостерігають протягом 24 годин або принаймні 6-10 годин після ін'єкції PTZ, особливо коли точки захоплення досягають 3 або вище. Хоча система спостереження за тваринами потрібна для спостереження за твариною протягом усього дня, тривале спостереження має вирішальне значення для глибокого розуміння епілепсії. Крім того, тривалість вилучення та затримка вилучення є корисними заходами для збору. Ці вимірювання важливі, коли змінюються тривалість вилучення та затримка з точки зору часу та тяжкості нападу.

Досліджено гістопатологію після вилучення тварин, що працюють на хімічному паливі, особливо в гіпокампі. Повторювані напади або SE викликають моховий паросток волокон, 27, 28, аномальну міграцію гранульованих нейронів новонароджених 25, 29, астрогліоз в гіпокампі 30 та апоптоз пірамідних нейронів 31, 32. ці гістологічні зміни мозку порушують неврологічні функції у хворих на епілепсію. Наприклад, асоціація епілепсії з розладом спектру аутизму (РАС) та інтелектуальною вадою (ІД) визнана 51, 52, 53. Чи викликають епілептичні напади РАС і чи АСД та ІД викликають епілептичні симптоми, все ще є складним питанням. Недавні дослідження показали, що напади, опосередковані PTZ, індукують ASD-подібні соціально-когнітивні порушення 54 та ID-подібні дефіцити навчання 55, 56, 57. Ці результати показують, що опосередкована епілепсією гістопатологія викликає нервову дисфункцію та психічні розлади.

Гістологічні зміни, спричинені епілепсією, потребують часу на розвиток після індукції судом. Фармакологічна індукція судом корисна в цьому плані, оскільки дослідники можуть контролювати час, кількість та тяжкість судом у тварин. Включаючи хімічне займання, тваринні моделі епілептогенезу продовжують сприяти дослідженню механізму індукції епілепсії та пов'язаних з цим нейрофізіологічних розладів.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Автори не заявляють про конфлікт інтересів.