Інтерес до біологічного аналізу, заснованого на ферментативній діяльності одноклітинних зелених водоростей для
Ферментативні заходи з цікавим потенціалом
Лужна фосфатаза
Існує безліч естераз (карбоксил-естерази, ацетил-естерази, холестеринові естерази тощо), які відіграють різну роль у метаболізмі. Ферменти, що використовуються в тестах, належать до групи холінестераз. Ці ферменти відіграють роль нейромедіаторів у деяких видів, проте у рослин продемонстровано ненейрональну активність, зокрема роль у поглинанні води та фотосинтезі [5]. Цікавість цих ферментів для нашого дослідження полягає в тому, що їх активність знижується за наявності певних видів інсектицидів, таких як карбамати або фосфорорганічні [1,2,3]. Кількісна оцінка цього зниження активності дозволить визначити наявність цих пестицидів у водному матриксі. Активність цих ферментів тим цікавіша, що вона нечутлива до присутності важких металів [2]. Тому цей тест апріорно доповнює аналіз на лужну фосфатазу. Інтерес до біопроби
Застосування біоаналізів, заснованих на метаболізмі водоростей, має ряд переваг: реакція, отримана з використанням цілих клітин (тобто культури водоростей без денатурації) організму, що представляє основу водної трофіки систем, швидкий результат, реакція на суміш різноманітний склад, що включає біодоступність забруднюючих речовин, синергетичну або антагоністичну дію різних складових. Однак ця реакція залишається якісною. Поточна мета - оцінити інтерес біоаналізів на основі метаболізму водоростей, щоб дозволити виявлення забруднюючих речовин у складній матриці (наприклад, у випадку міських скидів) і, таким чином, отримати економію від масштабу з точки зору фізико-хімічного аналізу.
Експерименти на штормових водозливах (DO)
Навчальні сайти
НО, обрані для цього дослідження, були обрані за кількома критеріями: доступність скиду, тип мережі (унітарна, окрема) або навколишнє середовище (землекористування, урбанізація тощо).
Вимірювання активності метаболізму
Водорості хлорели вульгаріс культивують у середовищах, приготованих за стандартом AFNOR T90-304 [6]. Ці середовища дозволяють задовольнити всі харчові потреби, необхідні для росту водоростей. Культури оновлюються протягом року за допомогою регулярної пересадки (періодичність: кожні 10-15 днів). Для отримання максимальної активності лужної фосфатази водорості повинні вичерпати весь свій внутрішній фосфор. Тому водорості в середовищі AFNOR пересівають у фазі експоненціального росту в середовищі AFNOR без фосфату. Ця стадія називається голодуванням і триває 21 день. Пересадку водоростей проводять у стерильних умовах з використанням витяжки з ламінарним потоком та пальника Бунзена. Потім водорості поміщають при перемішуванні в темну кімнату, кондиціоновану при температурі 20 ° C при освітленні з інтенсивністю світла, встановленою на рівні 5000 люкс.
Частина кожного зразка зібраних ОД фільтрується за допомогою вакуумної системи фільтрації. Використовується фільтрувальний папір марки Whatman (Cat No 1442 070), діаметром 70 мм і пористістю 2,5 мкм. Він підходить для утримання великої частини суспендованих речовин. Інша частина не фільтрується. Потім всі зразки автоклавують протягом 2 годин при температурі 120 ° C для їх стерилізації. Консервативний зразок поміщають у морозильну камеру при температурі -4 ° С. Зразки, відфільтровані автоклавом та зразки, призначені лише для автоклавування, зберігаються в холодильнику протягом двох місяців. Ці два зразки дозволять розрізнити ефект відфільтрованої суміші (розчинна фаза) та ефект сирої суміші (розчинний + тверді частинки).
Опромінення водоростей зразками OD було встановлено на 2 години. Дійсно, попередні випробування, проведені в нашій лабораторії з часом експозиції 4 години та 24 години, підтвердили тенденції, видимі через 2 години. В кінці експозиції центрифугування водоростей використовується для обробки матеріалу водоростей, що зазнає дії сумішей, уникаючи паразитарних флуоресценцій, які відходи можуть виділяти.
Лужна фосфатаза - це фермент, активність якого знижується у присутності важких металів. Тут нас цікавить активність мембранної лужної фосфатази Chlorella vulgaris.
Метил-умбелферил-фосфат (MUP) - це субстрат, необхідний водорості для того, щоб фосфатаза водоростей розкладала її та утворювала метил-умбеліфелірон (MUF), продукт, який флуоресцирує відповідно до пари збудження-емісії 355 нм - 460 нм. Тому активність ферменту пропорційна інтенсивності виявленої флуоресценції. Вимірювання активності естерази Естерази - це ферменти, активність яких змінюється у присутності певних видів інсектицидів, зокрема фосфорорганічних або карбаматних. Механізм дії цих інсектицидів пов’язаний з їх схожістю з природними субстратами. Молекули, такі як фосфорорганічні та карбамати, конкурують із субстратом та модифікують активність ферменту [1]. Вимірювання проводяться з тим самим обладнанням, що і для активності лужної фосфатази. В якості субстрату використовується флуоресцеїндіацетат (FDA). Гідроліз цієї молекули естеразами призводить до утворення флуоресцеїну, молекули, який флуоресцирує відповідно до пари збудження-емісії 480 нм-538 нм.
Висновки
Бібліографія
[1] Chouteau, C., 2004, Розробка біферментативного кондуктиметричного біосенсора з клітинами водоростей, Теза. Докторська школа: хімія Ліона.
[2] Guédri, H, 2010, Розробка біосенсорів для вимірювання ферментативної активності клітин водоростей для моніторингу водних середовищ. Докторська школа: хімія Ліона.
[3] Ферро, Y, 2013 р. Оцінка впливу міських скидів дощової погоди на водоросливий відсік водних екосистем, розробка інструментів для моніторингу приймаючих середовищ. Дисертація, докторантура хімії: Ліон.
[4] Дюр'є К., Тран-Мінь С., Оптичний біосенсор водоростей з використанням лужної фосфатази для визначення важких металів, Екотоксикологія та екологічна безпека 51, 206-209, 2003.
[5] Весслер, І, Кілбінгер, Х., Біттінгер, Ф. та ін. Ненейрональна холінергічна система. Біологічна роль ненейронального ацетилхоліну у рослин і людини. Японський журнал фармакології, 2001, том 85, № 1, стор. 2-10.
[6] Стандарт AFNOR T90-304, 1983, формування LC олігосередовища.