Кардіоміоцити, отримані із стовбурових клітин після трансплантації кісткового мозку та серця - a
Анотація
вступ
Загальновизнано, що кардіоміоцити становлять стабільну популяцію без потенціалу регенерації 1 або з обмеженими можливостями регенерації. 2, 3 Отже, єдиним засобом лікування серцевої недостатності на кінцевій стадії є трансплантація серця (HTX).
Існує припущення, що регенерація міокарда може відбуватися із стовбурових клітин з різних джерел (ембріональних, скелетних міобластів, гемопоетичних стовбурових клітин), і такий метод навіть пропонується як основа для лікування інфаркту міокарда. 1, 4, 5, 6 Місцева внутрішньосерцева ін’єкція (генетично модифікованих) стовбурових клітин є перспективною в експериментальних дослідженнях 6, 7, 8, хоча терапевтична придатність такого підходу залишається невизначеною. 9, 10 У деяких випадках введення цих клітин призвело до поліпшення гемодинаміки без доказів життєздатності трансплантації. 11, 12 Кількість досліджень людини щодо перенесення стовбурових клітин та подальшого відстеження все ще обмежена 4, 13, 14, оскільки відстеження стовбурових клітин in vivo все ще важко у людей. 15, 16
Недавні дослідження у пацієнтів після HTX або BMT показали приплив, повторне заселення та диференціацію клітин серця, отриманих з BM, відповідно від серцевого реципієнта або донора BMT. Однак кількість вторгнення стовбурових клітин, які диференціюються в кардіоміоцити, в різних експериментальних дослідженнях та дослідженнях на людях сильно варіюється. 9, 10, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 Ця неоднорідність, ймовірно, зумовлена завищенням кардіоміоцитів, що походять від господаря, через наявність великої кількості запальних клітин, отриманих від хазяїна та/або застосування різноманітних методів виявлення.
Таким чином, ми проаналізували тканину серця людини, отриману після розтину у пацієнтів, яким була проведена трансплантація серця або асимптотична трансплантація серця, використовуючи той самий набір методів виявлення. Клітини характеризувались гібридизацією in situ для Y-хромосоми (серце жінки у пацієнта чоловічої статі у випадку HTX та трансплантація чоловічої BM у пацієнта у випадку ОМТ). Для диференціації кардіоміоцитів господаря та донорів від інших інфільтруючих клітин (отриманих із стовбурових клітин) (ендотеліальні клітини, клітини запалення) гібридизацію Y-хромосоми in situ поєднували з імуногістохімічною характеристикою., Т-клітини (CD3), макрофаги (CD68), стовбурові клітини та ендотеліальні клітини (CD34) та кардіоміоцити (міозин 21). Це поєднувалося з 3D-лазерною скануючою конфокальною мікроскопією для присвоєння Y-позитивних ядер певному типу клітин. 22
У цьому дослідженні ми підтвердили наявність кардіоміоцитів, лейкоцитів та ендотеліальних клітин, отриманих із гемопоетичних стовбурових клітин, у міокарді пацієнтів після трансплантації серця або TSS, отриманого від BM. Крім того, ми показали, що кількість кардіоміоцитів, отриманих господарем, суттєво не відрізняється між пацієнтами після будь-якого типу трансплантації і становить не більше 1%.
Матеріали і методи
Матеріал пацієнта
Зразки серцевої тканини, інкрустовані парафіном, були вилучені з архівів розтину патологічного відділення Медичного центру Утрехтського університету. Був вивчений матеріал семи пацієнтів з ІМТ, яким пересадили чоловіків. Двоє пацієнтів із гендерно-томографічною комбінацією, яка відповідала статі, служили контролем. Крім того, матеріал було отримано від шести пацієнтів чоловічої статі з HTX, які отримали жіноче серце. Характеристики пацієнтів узагальнені в таблиці 1. Тканини з двох чоловічих сердець та двох сердець, отриманих при розтині пацієнтів без HTX та серцевих захворювань, використовувались як контрольні. До трансплантації всі пацієнти дали дозвіл використовувати свої тканини для дослідження. Всі тканини вкладали у парафін і розрізали на ділянки товщиною 6 мм.
Повний розмір таблиці
Флуоресценція in situ гібридизація
Для виявлення Y-хромосоми в парафінових зрізах використовували зонд SRY 23. Цей зонд маркували дигоксигеніном (DIG) за допомогою набору для псевдоперекладу (Roche, Мангейм, Німеччина) згідно з інструкціями виробника. FISH проводили, як описано раніше: 24 коротко депарафінованих предметних стекла перетравлювали в пепсині (0,11 г пепсину (1:10 000; Sigma, Steinheim, Німеччина)/100 мл гліцин/HCl буфер рН 2, 0) протягом 10 хв. . Після зневоднення предметних стекол і сушіння додавали 50 мкл міченого DIG зонду SRY і предметні стекла поміщали на конфорку при 98 ° C на 10 хв. Після інкубації протягом ночі при 37 ° С предметні стекла промивали у формаміді/SSC2x/50% Твін та 2x SSC/Твін протягом 15 та 10 хвилин відповідно. Потім предметні стекла блокували в 5% нежирному блокуючому реагенті в 4 х SSC і інкубували зі 100 мкл антитіла, міченого проти овечого анти-DIG флуоресцеїнового ізотіоціанату (Roche). Після промивання ядра фарбували йодидом пропідію. Флуоресценцію FITC та йодиду пропідію досліджували за стандартним флуоресцентним мікроскопом або за допомогою конфокальної лазерної скануючої мікроскопії (CLSM) та відзначали.
Подвійне фарбування FISH/IHC
Оцінка тканин
Пофарбовані зрізи тканини досліджували за допомогою стандартного флуоресцентного мікроскопа та за допомогою лазерної скануючої конфокальної системи візуалізації MRC-1000 (Bio-Rad Microscience, Геркулес, Каліфорнія, США). Слайди серцевої тканини були засліплені, а двоє незалежних експертів оцінили клітини, позитивні на Y-міозин та Y-CD34. Ділянки, багаті сполучною тканиною та/або ділянки щільних інфільтратів лімфоцитів не враховувались. Для найкращої візуалізації сигналів Y-хромосоми було підраховано 1000 ядер серця на предметне скло за найкращим чином, щоб визначити клітини серцевого м’яза. Ядра повинні були бути повністю оточені міозином, а крім того, були виключені волокна, що містять більше одного ядра. У тому ж мікроскопічному полі також підраховували загальну кількість позитивних клітин Y-хромосом, крім кардіоміоцитів. Ефективність зонда Y-хромосоми визначали, підраховуючи як загальну кількість ядер у чоловічому контрольному серці, так і кількість тих ядер, що містять сигнал Y.
статистичний аналіз
Для статистичного аналізу було проведено t-тест Стьюдента за допомогою програмного забезпечення Prism. Дані виражали як середнє значення та значення P. Значення P менше 0,05 вважали значущими.
Результати
Y-хромосомні позитивні кардіоміоцити
Позитивні клітини Y-хромосоми виявляються в різних контрольних тканинах. ( в ) Наявність позитивних клітин для Y-хромосоми у чоловічої мигдалини. Зверніть увагу на різницю у відсотках позитивних клітин в епітелії (70–80%) та лімфоїдній тканині (> 95%; × 200). ( ) Позитивне чоловіче контрольне серце. У кардіоміоцитах сигнал Y-хромосоми був виявлений у 45,9% клітин (х 200). ( проти ) Позитивного сигналу щодо Y-хромосоми не спостерігалося в нормальній тканині жіночого серця (× 200). ( d ) Трансплантований (жіночий) серцевий міокард з кількістю інфільтрованих одноядерних клітин (реципієнт-самець), які всі виражають позитивний сигнал Y (× 400).
Повнорозмірне зображення
Характеристика позитивних кардіоміоцитів Y-хромосом. ( в ) Наявність чоловічого кардіоміоциту, похідного від ВМ (жовта стрілка) у серці пацієнта з ОМТ ( ) Вертикальний переріз панелі a. Розташування вертикальної розгортки вказується між білими стрілками. Це зображення показує, що сигнал від Y-хромосоми присутній в ядрі цієї клітини. ( проти ) Позитивне чоловіче контрольне серце. Сигнал від Y-хромосоми в позитивному контролі, хоча і слабкий, був придатним для оцінки під флуоресцентним мікроскопом. Шкали шкали представляють 10 мкм.
Повнорозмірне зображення
Повний розмір таблиці
У контрольних чоловічих тканинах Y-хромосоми було легко виявити, а відсоток позитивних клітин змінювався залежно від досліджуваної тканини. Як показано на малюнку 1, в епітелії мигдаликів виявлено відсоток 70-80, а в лімфоїдній тканині більше 95%, що вказує на те, що відсоток позитивних Y-клітин з малими ядрами вищий, ніж у тканинах великих розмірів. ядра. Як результат, у контрольних чоловічих серцях відсоток Y-позитивних ядер кардіоміоцитів становив 45,9%, що вказує на те, що згідно з цією процедурою приблизно у половини ядер кардіоміоцитів була розташована Y-хромосома поза площиною. Рисунок 1, Рисунок 1 . 2в). У серцях жінок, які використовувались як негативний контроль, позитивності щодо Y не спостерігалося. У трансплантованих серцях майже всі інфільтровані мононуклеарні клітини були Y-позитивними (рис. 1г).
Не-Y хромосомні позитивні кардіоміоцити
Для порівняння екзогенних кардіоміоцитів та припливу з некардіоміоцитів підраховували загальну кількість Y-позитивних клітин у зафарбованих міозином предметних стеклах в тих самих полях, що і 1000 кардіоміоцитів. Таблиця 2 показує, що кількість не-Y-позитивних кардіоміоцитів вища (середнє значення 93,0 у BMT та 117,7 у HTX), ніж кількість Y-позитивних кардіоміоцитів (у середньому: 1,7 у BMT та 4, 2 у HTX) у мікроскопічному поля, що використовуються рахунок.
На рисунку 3 кількість Y-позитивних кардіоміоцитів показано як функцію часу (нелінійна шкала для BMT та HTX) та порівняно з кількістю Y-позитивних некардіоміоцитів. Цей показник показує, що кількість Y-позитивних клітин з часом не збільшується; Це справедливо для кардіоміоцитів та інших клітин. Однак на ділянках серцевої тканини, інфільтрованих відносно великою кількістю Y-позитивних некардіоміоцитів, частка позитивних кардіоміоцитів має тенденцію до збільшення. Це було найбільш вражаючим у реципієнта BMT (на 49 день) та у реципієнта HTX (на 949 день). У реципієнта HTX велику кількість інфільтруючих клітин можна пояснити гострим відторгненням судин. Велику кількість інфільтруючих клітин у ММТ пацієнта не можна пояснити.
Кількість кардіоміоцитів, позитивних до Y хромосоми, як функція часу. Аналіз серцевої тканини хворих на HTT та BMT у жінок для визначення присутності позитивних клітин хромосомної Y. Кількість клітин вказана на 1000 підрахованих ядер кардіоміоцитів. Зверніть увагу на нелінійну шкалу на осі X та дві різні шкали на осі Y. Це вказує на кореляцію між кількістю позитивних (інфільтруючих) клітин Y-хромосоми та кількістю кардіоміоцитів, позитивних Y-хромосомі.
Повнорозмірне зображення
Як було показано подвійним фарбуванням CD45 та Y-FISH, більшість некардіоміоцитів з Y-хромосомою були інфільтруючими лейкоцитами (рис. 3а), з нормальним розподілом CD3 та CD68 (як описано раніше Schuurman et al. 26).
Між 10 і 20% не Y-позитивних кардіоміоцитів були CD34 позитивними (дані не наведені). Більшість CD34-позитивних Y-позитивних клітин були ендотеліальними клітинами, які локалізувались у дрібних капілярах (рис. 4b). У ендотелії великих судин не виявлено CD34-позитивних Y-позитивних клітин (рис. 4в). В одному окремому зрізі було виявлено одну Y34-позитивну клітину CD34 (рис. 4г). Це, швидше за все, була стовбурова клітина.
CD45 та CD34-Y позитивні клітини в тканині серця після трансплантації. ( в ) CD45-позитивна клітина між кардіоміоцитами після BMT. ( ) CD34-позитивна Y-клітина в стінці маленької кровоносної судини після HTX. ( проти ) У CD34-позитивному ендотелії великої кровоносної судини після ВМТ не спостерігали Y-позитивних клітин. ( d ) Одиночна CD34-позитивна клітина в міокарді після ВМТ, ймовірно, представляє стовбурову клітину. Смуга шкали представляє 10 мкм.
Повнорозмірне зображення
Обговорення
Це дослідження демонструє, що після BMT та HTX клітини, отримані з BM, потрапляють у серце і можуть диференціюватися в кардіоміоцити. Ці цифри здаються відносно низькими (середнє значення: 1,7/1000 кардіоміоцитів при ВМТ та 4,2/1000 при ХТХ), але враховуючи, що в нормальному чоловічому серці близько 50% клітин не фарбуються. Y-FISH, а загальне серце складається з 6 × 10 9 кардіоміоцитів, загальна кількість кардіоміоцитів, отриманих із стовбурових клітин, може додати до 2–5 × 10 7 кардіоміоцитів у серці пацієнтів з BMT та HTX. Очевидна відсутність видимої Y-хромосоми в половині клітин у зрізах пояснюється розташуванням Y-хромосоми поза площиною зрізу (це дослідження та Beltrami et al. 2).
Ці цифри добре узгоджуються з літературними даними, 18, 19, 27, хоча інші повідомляють набагато більші цифри. 2 Ці відмінності можуть бути спричинені різницею в методі відстеження (наприклад, відстеження попередньо мічених клітин ВМ), але, ймовірно, через завищення Y-позитивних кардіоміоцитів серед великої кількості інфільтруючих (чоловічих) запальних клітин. Тому необхідний надійний метод скринінгу подвійного фарбування (FISH у поєднанні з імуногістохімічною характеристикою клітин). Тривимірний скринінг за допомогою конфокальної лазерної мікроскопії також запобіжить помилковому трактуванню інфільтруючих клітин, розташованих під кардіоміоцитами, які в іншому випадку позначаються як позитивні кардіоміоцити. 20
Це дослідження показало, що існувала позитивна кореляція між кількістю кардіоміоцитів, отриманих із стовбурових клітин, і часткою інфільтруючих клітин. Такий клітинний інфільтрат, що з’являється під час запальної реакції, може призвести до низки стовбурових клітин, які в кінцевому підсумку можуть диференціюватися в кардіоміоцити. Однак відсутність CD34-позитивних стовбурових клітин у цих інфільтратах суперечить цьому припущенню.
Це одна з перших статей про приплив стовбурових клітин, які диференціюються в кардіоміоцити у асиметричних реципієнтів HTX та BMT між чоловіками та жінками. Цікаво, що кількість Y-позитивних кардіоміоцитів не збільшувалась в надурочний час у пацієнтів з BMT та HTX, і, крім того, ми не виявили значущої різниці між BMT та HTX сердець у кількості похідних кардіоміоцитів. Стовбурових клітин BM. Це нещодавно спостерігали також Thiele та співавт. У нашому дослідженні спостерігалася тенденція до збільшення кількості позитивних Y кардіоміоцитів, отриманих із стовбурових клітин, у групі пацієнтів з HTX. Це може свідчити про те, що шкода, завдана серцю під час процедури HTX (пошкодження внаслідок ішемії та реперфузії), більша, ніж у серці після ОМТ. Крім того, кореляція між великою кількістю запальних клітин та відносно високою кількістю Y-хромосомних позитивних кардіоміоцитів підтверджує цю гіпотезу. Нанесену шкоду необхідно виправити, і тому, як вважають, для сприяння цьому процесу потрібно більше стовбурових клітин.
Багато інших клітин господаря або похідних від BM спостерігали в серцях після HTX та BMT. По-перше, спостерігалося багато запальних одноядерних клітин Y-хромосоми, особливо в пересаджених серцях. Склад інфільтрату був подібним до того, який раніше спостерігала наша група. 26, 31
Інша основна популяція клітин, часто позитивна для Y-хромосоми, - це CD34-позитивні ендотеліальні клітини. 27, 30 Цікаво, що ці ендотеліальні клітини CD34 + Y-хромосом спостерігались не у великих судинах, а лише в дрібних капілярах (це дослідження та Minami et al. 27). Ми не можемо виключити, що лімфоцити, які мігрують через ендотелій, могли сприяти спостережуваній позитивності ендотеліальних клітин, оскільки інфільтруючі клітини часто виявляються вклиненими між ендотеліальними клітинами. Однак в ендотеліальних клітинах, зарахованих як Y-позитивні, позитивність для CD34 повністю охоплювала ядро, позитивне для Y-хромосоми. Порівняно низька кількість CD34-позитивних ендотеліальних клітин контрастує з іншими дослідженнями, в яких було відносно мало. Висока кількість циркулюючих ендотеліальних клітини, які повторно заселяють судини у реципієнтів трансплантованих органів та ММ. 27, 32, 33, 34
Підводячи підсумок, це дослідження вказує на те, що кількість кардіоміоцитів, отриманих господарем, як при лікуванні ВМТ, так і при HTX, не суттєво відрізняється між двома типами трансплантації і що вона становить не більше 1% від загальної кількості.