Кількісне визначення хемотаксичної активності моноцитів in vivo та характеристика моноцитів крові

Резюме

Тут ми представляємо протокол кількісної оцінки хемотаксичної активності моноцитів крові на мишачих моделях для оцінки впливу харчових, фармакологічних та генетичних втручань на моноцити крові та макрофагів, отриманих з денмонцитів, на мишачих моделях з моноцит-хемоаттрактантним білком-1 (MCP-1) -зарядні гелеві пробки з вентильованою мембраною.

Анотація

Вступ

Протокол

Усі методи, описані в цьому протоколі, схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Медичної школи Вейк-Форест.

1. Приготування розчину базової мембрани, навантаженого MCP-1, із зниженим фактором росту

ПРИМІТКА: Це стерильна процедура.

2. Ін’єкція розчину, отриманого з підвальної мембрани

3. Збирання гелевої пробки базової мембрани

4. Переварити гелеву пробку, отриману з базальної мембрани

5. Визначення клітинного складу в суспензії клітин за допомогою одноклітинного аналізу вестерн-блот (scWB)

6. Витягніть чіп scWB

Репрезентативні результати

Щоб отримати доступ до реакції моноцитів крові на хемолокант, ми ввели в лівий і правий бік кожної миші розчин, що отримує мембрану, дерасту, завантажену транспортним засобом. Гелеві пробки базової мембрани були видалені, від'єднані та клітини, набрані в кожну пробку через 1, 3 та 5 днів після ін'єкцій (Рисунок 1А). Віднімаючи кількість комірок у роз'ємі, завантаженому транспортним засобом (розімкнуті смуги), від кількості осередків у роз'ємі, завантаженому MCP-1 (закриті смуги), ми отримали кількість комірок, які були спеціально набрані у відповідь на MCP-1 (номер осередку, Малюнок 1B). Ми спостерігали прискорений набір та накопичення клітин MCP-1 протягом 5-денного періоду, при цьому показники зростали з 31000 клітин/день (день 1) до 78000 клітин/день (день 3) та 136000 клітин/день на 5-й день (Малюнок 1B).

Статистична оцінка даних, показаних тут, проводилася за допомогою програмного забезпечення для аналізу (наприклад, SigmaPlot 14). Для порівняння середніх значень між експериментальними групами використовували ANOVA, а потім тест ЛСД Фішера. Усі дані представлені як середнє значення SD для щонайменше 3 незалежних експериментів. Результати були на рівні Р Малюнок 1 : Кількісна оцінка клітин, які завербований у підшкірні гелеві пробки, отримані з дермембрани, у підвалі буде. (А.) Абсолютні номери осередків для завантажених у транспортний засіб (відкриті бруски) та заповнених MCP-1 мембранних гелевих заглушок (закриті бруски) (B.) Кількість клітин, набраних MCP-1, у гелеві пробки, отримані з мембрани льоху, розраховували як різницю в кількості клітин між MCP-1 та завантаженими транспортними засобами. Результати відображаються як середнє значення sD (n = 4). Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

активності

Малюнок 2 : Аналіз клітинних популяцій, набраних у гелеві пробки базової мембрани за допомогою одноклітинного Вестерн-блот-аналізу були. (A + B) Репрезентативні приклади для аналізу SCWB навантаженого автомобіля (Контроль) та роз’єм для підключення MCP-1 (MCP-1) показані виділені від миші через три дні після ін’єкції. Чіпи, мічені антитілами до CD45, CD11b та ​​F4/80, а потім флуоресцентні вторинні антитіла, як описано в протоколі. Інтенсивність флуоресценції міченої смуги для кожної окремо взятої клітини відображається як область кінчика. (C + D) Популяції клітин були ідентифіковані як моноцити (CD11b + F4/80 -,), макрофаги (CD11b + F4/80 + плюс CD11b - F4/80 +,) або як немоноцитарні лейкоцити (CD45 +,). Решта комірок отримали назву "інші" (). Результати представлені як середнє значення sD (n = 3). Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

кількісне

Малюнок 3 : Вміст моноцитів і макрофагів у гелевих пробках від Dererampen. Кількісний аналіз рівня набраних моноцитів та макрофагів у пробках, завантажених транспортним засобом та MCP-1, які були видалені на 1, 3 та 5 дні після ін'єкції. Значення виражаються у відсотках від загальної популяції клітин (A + B) і в абсолютній кількості комірок на роз’єм (C +Д.) відображається. Результати відображаються як середнє значення sD (n = 3). Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Обговорення

Існує ряд обмежень щодо аналізу, які слід врахувати. По-перше, маніпуляції з мишами, включаючи анестезію, ін’єкцію розчинів, отриманих з базальної мембрани, та хірургічне полоскання вимагають практики для створення індивідуальних пробок та відтворюваних даних. По-друге, хоча більшість клітин, які набираються в пробки, завантажені MCP-1, є моноцитами та макрофагами, значна частина - ні. Це може вплинути на інтерпретацію інших, не одиночних клітинних аналітичних досліджень, проведених на цій популяції клітин. Оскільки умови лізису клітин для scWB помірні, відстань міграції білків може відхилятися від стандартного WB і не корелювати з розміром білка. Тому для кожного нового протеїну та первинного антитіла, що підлягає тестуванню, необхідно перевірити як лізис клітин, так і час роботи.