Ключові сигнали кальцію спрацьовують під час плазмодієвої інвазії еритроцитів
Теми
Анотація
вступ
Тут ми генеруємо моноклональні антитіла (mAbs) проти області зв'язування еритроцитів Rf-3 PfRH1 (член сімейства RH P. falciparum 7). Ми показуємо, що mAbs PfRH1 блокують інвазію мерозоїтів, спеціально інгібуючи передачу сигналів кальцію у паразита, а не безпосередньо перешкоджаючи зв’язуванню паразита з еритроцитами. Далі ми показуємо, що інгібування цього кальцієвого сигналу перешкоджає розряду EBA175 і, таким чином, запобігає утворенню з’єднань (ключовий етап, який дозволяє паразиту проникати в еритроцит за допомогою двигуна до актину-міозину 3). Наші результати демонструють, що PfRH1 та EBA175 мають різні функції, PfRH1 виконує початкову роль виявлення та трансдукції сигналу, що призводить до подальшого звільнення EBA175 від мікронеми та утворення переходів. Ці нові знання можуть допомогти визначити нові цілі для протималярійного втручання.
Результати
PfRH1-специфічні mAbs інгібують інвазію мерозоїтів
У цій роботі ми використовуємо PfRH1 для вивчення основних внутрішньоклітинних сигнальних подій, що ведуть до успішної інвазії еритроцитів. Раніше ми показали, що антитіла, націлені на область зв'язування реритроцитів (RII-3) PfRH1 (рис. 1а), можуть інгібувати інвазію мерозоїтів 7. Тут ми створили чотири моноклональні антитіла (Acb: C49, C41, C2 та C50) проти цієї області та підтвердили їх специфічність за допомогою аналізів вестерн-блот та імунофлюоресценції. Всі антитіла розпізнають очікувану оброблену форму PfRH1 обробленої 240 та 140 кДа в екстрактах супернатанту, мерозоїтів та шизонтів з паразитичної культури T994, тоді як у лінії інактивації T994ARHH1 від PfRH1 не виявлено жодної еквівалентної смуги (додаткове зображення S1a - c). Тести імунофлуоресценції показали, що всі mAb давали частково локалізовані точкові мотиви з EBA175 (відомий білок мікронеми) на апікальному кінці мерозоїтів у T994, що відповідає передбачуваному розташуванню PfRH1 (рис. S1d додатково). У T994ΔRH1 (додатковий малюнок S1e) не спостерігалося фарбування, що ще більше підтверджує специфічність mAbs.
( в ) Повнорозмірний PfRH1, що включає сигнальну послідовність (SS, червона), область зв'язування еритроцитів RII-3 (синя, що охоплює амінокислоти 500-833) та трансмембранний домен (TM, жовтий). ( , проти ) Аналізи інгібування інвазії з використанням mAb анти-PfRH1 (IgG) у T994 ( ) і T994ΔRH1 ( проти ). Гістограми показують середнє значення ± тиж. n = 3. * P ≤0.0003 за односторонньою ANOVA, що вказує на те, що C49 успішно блокував інвазію T994 порівняно з інвазією в присутності C2 і C50. + P ≤ 0, 0003 одностороннім ANOVA, що вказує на те, що C41 суттєво пригнічує інвазію порівняно з C2 і C50.
Повнорозмірне зображення
Інгібуючі mAbs блокують інвазію перед утворенням переходу
Повнорозмірне зображення
Інгібуючі mAbs PfRH1 блокують передачу сигналів Ca 2+ під час інвазії
Повнорозмірне зображення
Життєздатність мерозоїтів
Повнорозмірне зображення
Інгібітор EBA175 mAb не впливає на сигналізацію Ca 2+
Відповідно до опублікованих даних, наші результати вказують на те, що PfRH1 відіграє безпосередню роль у вивільненні Ca 2+, який згодом запускає секрецію мікронеми та EBA175. Якщо це дійсно правильно, можна було б очікувати, що блокування функції EBA175 і, отже, формування переходів не матиме ніякого впливу на сигналізацію Ca 2+. Щоб дослідити це далі, ми використали mAb R215, що блокує вторгнення, який націлений на область EBA175 II (посилання 30). Як описано раніше, mAb R215 здатний блокувати інвазію залежно від дози, з максимальним інгібуванням приблизно 47,7% ± 1,11 при 0,25 мг мл -1 (рис. 5а) 30. Однак це антитіло не впливає на внутрішньоклітинні сигнали Ca 2+ під час інвазії (рис. 5b, додаткові дані 1-6). Цей результат підтверджує, що антиінвазійні антитіла, націлені на EBA175, діють після сигналізації Ca 2+, тоді як ті, що націлені на PfRH1, діють до сигналізації Ca 2+, і чітко підкреслює різні ролі, які відіграють PfRH1 та EBA175.
( в ) Аналіз інгібування інвазії з використанням анти-EBA175 mAb R215 у паразитах T994. Стовпчасті графіки демонструють пригнічення інвазії різних концентрацій (0,25-0,008 мг мл -1) специфічного до EBA175 mAb R215 у T994. Гістограми показують середнє значення ± тиж. n = 3. ( ) Рівні цитозольного Ca 2+ виявляли за допомогою флуоресцентного планшетного зчитувача. Мерозоїти T994, попередньо завантажені Fluo-4AM, інкубували з еритроцитами у відсутність (RBC) або в присутності R215 (RBC + R215 (0,2 мг мл -1)). Іонофор Ca 2+ A23187 (RBC + A23187) використовували як позитивний контроль. Зміни рівня цитозольного Ca 2+ під час інвазії мерозоїтів оцінювали з часом за допомогою флуоресцентного планшетного зчитувача. ≤ΔF (t), що відображає загальні зміни рівня цитозольного Ca 2+ у мерозоїтах, будували графіком як функцію часу. Експериментальні дані були представлені як середнє значення ± тиждень; n = 3.
Повнорозмірне зображення
Інгібуючі mAbs PfRH1 блокують експресію EBA175
Повнорозмірне зображення
$ config [ads_text16] не знайдено
Обговорення
Надалі тепер буде важливо додатково визначити механізм, за допомогою якого опосередкований RH-сигнал передається мерозоїту для ініціації вивільнення Ca 2+. Загалом, наші результати дають нові уявлення про тонкорегульований сигнальний каскад, який необхідний для забезпечення успішної інвазії мерозоїту та відкриття шляху для аналізу сигнальних шляхів, задіяних у регульованій секреції верхівкових органел під час інвазії. Разом це забезпечить нам краще розуміння механізмів передачі сигналів, важливих для вторгнення мерозоїтів, і те, як ці процеси можуть стати новою метою для втручання в малярію.
Методи
Штами і культура P. falciparum
Лінії паразитів P. falciparum T994, W2mef (MR4) та T994ΔRH1 (посилання 40) культивували у свіжих еритроцитах здорових донорів людини (після отримання поінформованої згоди) та RPMI, доповненому 5% альбомом (Invitrogen) 41. Паразитам W2mef дозволяли рости в еритроцитах, оброблених 10 мО мл-1 нейрамінідази (Нм; Рош). Через 2–3 тижні паразит W2mef адаптується і зростає в оброблених нейрамінідазою еритроцитах (незалежних від сиалової кислоти) 7, 26. Цей паразит, що змінився, був названий паразитом W2mef/NM.
Вироблення та очищення моноклональних антитіл до PfRH1
Клітини гібридоми PfRH1 були розроблені компанією BioGenes (Німеччина) з використанням очищеного розчинного рекомбінантного білка PfRH1-RII-3 (посилання 7). Позитивно відібрані клітини гібридоми культивували в 2% FBS-DMEM (Invitrogen). Очищення IgG mAbs PfRH1 з клітинного культурального середовища проводили за допомогою стандартних процедур очищення (HiTrap Protein G HP, GE healthcare). Фрагмент моноклонального антитіла C41 Fab отримували та очищали за допомогою стандартних процедур (Pierce Fab Micro Preparation Kit, Thermo Scientific). Справжність Fab-фрагмента підтверджена 12% SDS-PAGE (Bio-Rad) з подальшим фарбуванням синього кумасі (Sigma), що дало одну смужку
50 кДа за невідновлюваних умов.
Вестерн-блот екстрактів паразитів та супернатантів культури
Аналіз інгібування вторгнення
Синхронізовані шизонти на пізній стадії очистили, і 160 мкл суспензії паразитів додали у двох примірниках у 96-лункову мікропланшетну пласку з дном, що містить mAbs PfRH1 (0,008–0,5 мг мл -1), очищений фрагмент C41 Fab (0,008–0,5 мг мл -1) або EBA175 mAb R215 (0,008-0,25 мг мл -1), відповідно. Всього було зараховано 1000 еритроцитів на наявність кілець на мазках, пофарбованих Гімзою, через 24 години для реінвазії. Інвазія (Inv) оцінювалася як (%) паразитемія. (%) Паразитемія = (загальна кількість інфікованих кільцями еритроцитів/загальна кількість еритроцитів) × 100. Інвазію у присутності mAb порівнювали з позитивним контролем інвазії тих самих ліній паразитів при нормальній повній RPMI. Ефективність інгібування інвазії визначали наступним чином: (%) ефективність інгібування = (1 - Inv (mAbs) розведення/Inv (позитивний)) × 100. Наведені дані отримані з трьох біологічних копій. Кожна біологічна копія має дві технічні копії. Експериментальні дані представлені як середнє значення ± sem
Аналізи зв’язування еритроцитів
Сотню мікролітрів супернатанту культури паразитів T994 інкубували зі 100 мкл упакованих нормальних еритроцитів у присутності mAb PfRH1 (з кінцевою концентрацією від 0,3 до 0,035 мг мл -1) при 37 ° C протягом 1 год 7, 26 .
Аналіз блокування мерозоїтових з'єднань
Мерозоїти були затримані в стику еритроцитів обробкою цитохалазином D (Cyto D) (Sigma) 26, 27. Очищені паразити шизонта на пізній стадії додавали до готового RPMI, що містить свіжі еритроцити, в 96-лункових планшетах. Cyto D додавали до кінцевої концентрації 0,1 мкМ. Моноблоки PfRH1, при необхідності, також були при концентрації 0,2 мг мл -1. Після 8-годинної інкубації за допомогою світлової мікроскопії готували мазки, зафарбовані Гімзою (Sigma), для підрахунку мерозоїтів, заарештованих при утворенні з'єднань. Всього було зараховано 1000 еритроцитів. Кількість заарештованих мезозоїтів у місці з'єднання у присутності mAbs порівнювали з такою у позитивному контролі того самого паразита. Ефективність гальмування мерозоїтів в місцях з'єднання визначали наступним чином:% інгібування мезозоїту в стику = (1 - загальна кількість мезозоїтів у місцях з'єднання (mAbs)/загальна кількість мерозоїтів у місцях з'єднання (позитивний контроль)) × 100. Дані наведені з трьох біологічних повторень. Кожна біологічна копія має дві технічні копії. Експериментальні дані представлені як середнє значення ± sem
Вираз чотирьох областей, що перекриваються, з RII-3
Чотири N-кінцеві фрагменти, що перекриваються з RII-3, ампліфікували за допомогою ПЛР, експресували як рекомбінантні білки His-tag за допомогою BL21 (DE3) (Stratagene) 7, названого N1 (500–692 амінокислоти (aa)), N2 (500–726 aa), N3 (500–746 aa) та N4 (500–773 aa), потім 12% SDS-PAGE та зондують mAbs C49, C41, C2 та C50 відповідно (1: 5 000). В якості контролю навантаження використовували mAb проти 6-кратного His-мітки (αHis, 1: 5, 000, Clonetech). Для ПЛР, прямий праймер 5'-Був GACCATATGTTACAAATAGTACAACAAAAACTTTTAGAAATC-3 'і зворотний праймер 5'-AACCTCGAGAGAAATAAGTTGAATCGTCTCATTATTTT Були-3' (N 1), 5'-AACCTCGAGGGATTTAAGAAGATTTTGGATGTTTT-3 '(N 2), 5'-AACCTCGAGTTGTTTTAATATATATTTAGAAATTGTGTCTATGAA-3' ( N3) та 5′-AACCTCGAGGTTTTGTTCATTTTTTATTTCTTCAAGAT-3 ′ (N4).
Вироблення пептидів та відображення епітопу PfRH1
Відеомікроскопія в прямому ефірі
Для відеомікроскопії 23 в реальному часі ми використовували спостерігач Axiovert 200 M з камерою 37 ° C з постійною подачею 5% CO 2. П'ять-десять відсотків паразитів пізньої шизонтної стадії розводили при 1: 100 у повній RPMI. Відео в прямому ефірі виконувалось із використанням посуду зі скляного дна 35 мм. Відео було знято у присутності або відсутності mAbs PfRH1 (C2, C41, C49 і C50) з кінцевою концентрацією 0,2 мг мл -1. Для отримання зображень використовували камеру AxioCam HRm та програмне забезпечення Axiovision, або камеру Cool SNAP та програмне забезпечення MetaMorph. Відеофайли були підготовлені за допомогою Image J.
Виділення мерозоїтів P. falciparum
Очищені шизонти P. falciparum ресуспендували в теплому повному RPMI і давали їм розриватися і випускати мерозоїти протягом 2 год при 37 ° С. Культури, що містять нерозбитий шизонт і вивільнені мерозоїти, центрифугували при 2 200 об/хв (942 г) на центрифузі Eppendorf 5810R протягом 3 хв, щоб відокремити вивільнені мерозоїти від неруйнованих шизонтів та неінфікованих еритроцитів. Потім супернатанти, що містять вільні мерозоїти, потім центрифугували при 5000 об/хв (4500 г, Sigma 3K15) протягом 3 хв для збору мерозоїтів. Мерозоїти негайно ресуспендували в теплому повному середовищі RPMI для подальших досліджень.
Аналіз життєздатності вільних мерозоїтів
Аналізи на вторгнення еритроцитів проводили паралельно для оцінки життєздатності ізольованих вільних мерозоїтів, випробуваних для вимірювання Ca 2+. Через 24–30 год. Після інвазії заражені кільцями інфіковані еритроцити оцінювали за допомогою фарбування за Гімсою (Sigma, США). Рівень інвазії визначали як (%) паразитемії. Дані були показані з трьох біологічних копій.
Кінетика інвазії мерозоїтів при лікуванні гепарином
Вимірювання Ca 2+ у реальному часі в мерозоїтах під час вторгнення
Вимірювання Ca 2+ за допомогою проточної цитометрії в мерозоїтах під час інвазії
Вимірювання внутрішньоклітинних рівнів Са 2+ на вільних мерозоїтах
Імунофлуоресцентні тести та мікроскопія
Синхронізовані шизонти попередньої стадії висівали на покриття і сушили на повітрі, потім фіксували в ацетоні (Merck) протягом 5 хв при кімнатній температурі. Мазки інкубували з mAbs PfRH1 (1: 800) та ко-інкубували з кроликом a-EBA175 (1: 800) протягом 1 год у 3% -ному буфері BSA/PBS, після чого три рази протягом 5 хв у промиваннях у 1x PBS. Потім їх інкубували із сумішшю козячого IgG (H + L) козячого козячого анти-мишачого коза 594 та Alex Flour 488 (H + L) (1: 1000 відповідно, молекулярний зонд) козячого анти-кролячого IgG (H + L) . . Слайди промивали в 1x PBS три рази протягом 5 хвилин. Слайди сушили на повітрі, застосовували монтажне середовище, що містить DAPI (Vector Laboratories), і покривні склянки герметизували. Флуоресцентні зображення були зроблені за допомогою конфокального мікроскопа LSM510 (Carl Zeiss).
Аналіз імунофлуоресценції на мерозоїти
Ізольовані мерозоїти T994 інкубували зі стрептолізином O або без нього (SLO, Sigma) 51. Культуру промивали тричі неповним RPMI, потім фіксували 1% р-формальдегідом (Sigma) протягом 45 хв при кімнатній температурі з наступним центрифугуванням при 5000 об/хв (4500 г, Sigma 3K15) протягом 3 хв. Після двох промивань культуру інкубували з кролячим α-нуклеопорином 100 антитілом (α-Nup 100, 1: 500), маркером ядерної периферії або з кролячим α-ацетил-гістоном H3 (Lys9) антитілом (α-H3K9ac, 1: 500, Millipore), маркер гістону 32 протягом 45 хв при 37 ° C. Культуру промивали тричі в неповному RPMI, потім інкубували з козячим IgG (H + L) козла Alex Flour 594 (1/1000) або Alex Flour 488 козячий анти-кролячий IgG (H + L) (1/1000) з DAPI протягом 45 хв при кімнатній температурі. Культуру промивали три рази, а потім наносили на предметні стекла. Зображення були зроблені методом зворотної флуоресцентної мікроскопії Nikon TE2000-U.
Виявлення EBA175 на поверхні мерозоїтів методами на основі флуоресценції
Виявлення EBA175 на поверхні мерозоїтів методом проточної цитометрії
статистичний аналіз
Статистичне порівняння проводили з використанням одностороннього ANOVA, за необхідності. Рівень значущості був встановлений на рівні p 2+
Неопрацьовані абсолютні дані вимірювань з усіх експериментів сигналізації Ca 2+ наведені в додаткових даних 1-6.
Додаткова інформація
Як цитувати цю статтю: Гао, X. та ін. Тригери ключових кальцієвих сигналів під час інвазії еритроцитів під плазмодієм фальціпарум. Нат. Поширені. 4: 2862 doi: 10.1038/ncomms3862 (2013).