Laborjournal online Journalclub - бактерії пішли не так
Сігрід Марш
Illustr.: IStock/Наталя Яцкова; під редакцією JM
(12.10.2020) Лейпциг: Люди з ожирінням іноді страждають на порушення обміну речовин та діабет 2 типу. Дослідники показали, що у цих пацієнтів більше бактерій з кишечника потрапляє в навколишню жирову клітковину і викликає там запальні реакції: чим більше бактерій вони виявили, тим вище значення запалення і хворі пацієнти.
Більше половини дорослих у Німеччині мають надлишкову вагу, тому вони мають індекс маси тіла (ІМТ) понад 25 кг/м 2; близько 16 відсотків мають надмірну вагу (ожиріння; ІМТ більше 30 кг/м 2). Ожиріння впливає на ваше здоров’я, залежно від того, де накопичується жир. Зокрема, так званий вісцеральний жир, який оточує внутрішні органи черевної порожнини та захищає їх від механічних впливів, має тенденцію до розширення при надлишку їжі. Однак цей вісцеральний жир не просто валяється, він також виділяє різноманітні гормони та адипокіни. До них належать, наприклад, цитокіни, такі як інтерлейкін-6 (IL-6) та фактор некрозу пухлини (TNF) -α, або пептидний гормон адипонектин, модулятор інсуліну. Зрозуміло, що занадто велика кількість вісцерального жиру може вивести людський метаболізм з рівноваги.
Вісцеральне ожиріння є добре відомим фактором ризику для численних захворювань, наприклад, атеросклерозу, раку або діабету 2 типу. Близько семи мільйонів людей у Німеччині живуть із цукровим діабетом. Більше 95 відсотків хворих виявляють тип 2 - резистентність до інсуліну, яка часто підкрадається у літньому віці. Спочатку підшлункова залоза продовжує виробляти достатню кількість інсуліну - на відміну від діабету 1 типу - але він більше не засвоюється органом-мішенню. Це призводить до постійно підвищеного рівня цукру в крові, що, в свою чергу, сприяє пошкодженню органів та таким ускладненням, як інсульт та інфаркт. Окрім генетичної схильності та занадто малого фізичного навантаження, найважливішими факторами ризику діабету 2 типу є надмірна вага. 90 відсотків пацієнтів мають надлишкову вагу, чверть навіть страждають ожирінням.
Але чому деякі люди з ожирінням сильно хворіють на метаболізм, а інші - ні? Це питання задають дослідники клініки та поліклініки ендокринології, нефрології та ревматології університетської лікарні Лейпцига, точніше директор дослідження Пітер Ковач. Він є професором генетики ожиріння та діабету в Інтегрованому дослідницькому та лікувальному центрі захворювань ожирінням. Після навчання фармації у Словаччині Ковач приїхав до Грайфсвальда, де в 1998 р. Здобув ступінь доктора філософії з генетики діабету 2 типу. Після докторантури в Національному інституті охорони здоров’я у Феніксі (Арізона) він потрапив у Лейпциг. Там він зустрів лікаря Риму Чакарун. Ендокринолог працювала над адипокінами під час докторської дисертації, а згодом започаткувала дослідження щодо впливу мікробіома кишечника на ожиріння та метаболічні захворювання.
Це звучить як ідеальна комбінація для розгляду зв'язку між ожирінням та діабетом 2 типу. Дослідники особливо здивували, що запальні процеси спостерігались у жировій тканині багатьох людей з ожирінням. “Як частина дієти з високим вмістом жиру, інші дослідники годували мишей їжею, яка містила мічені флуоресценцією бактерії. Пізніше вони виявили фрагменти цих бактерій у жировій тканині », - повідомляє Чакароун. Чи бактерії спричинили запалення? "Отже, ми почали шукати бактерії в жировій тканині людини", - говорить Ковач. Результатом стала публікація в Gut, в якій першими авторами були Чакарун і (тоді ще) докторант Лукас Массьє (69: 1796-806).
Для дослідження Лейпцизькі дослідники завербували 75 пацієнтів (ІМТ в середньому 48 кг/м 2), які перенесли баріатричну операцію. Шунтування Шлунка Ру-ен-Y є одним із видів скорочення шлунка та скорочення тонкої кишки. Отже, їжа йде по об’їзній трасі через травний тракт. Це має допомогти людям зменшити вагу, серед іншого, тому що їжа засвоюється не повністю. 33 випробовуваних також були хворими на цукровий діабет 2 типу зі значно підвищеними показниками запалення та аномальними значеннями метаболізму глюкози в крові.
Під час процедури хірурги брали зразки підшкірного та вісцерального жиру - як можна стерильніші - з різних місць, таких як сальник (сітчаста структура на очеревині) або брижа (частина суспензії кишечника). З цих зразків тканин Массьє, Чакароун та його колеги виділили ДНК та РНК та виготовили зрізи тканини.
Насправді дослідники виявили бактеріальну ДНК в жировій тканині, хоча і в надзвичайно малій кількості. Лише 0,1-0,5 пікограма на мікрограм загальної ДНК надходили не від людини, а від бактерій. Під час секвенування бактеріального гена 16S рРНК у зразках тканин вони виявили велику кількість слідів. Деякі з них можна виключити як забруднення за допомогою біоінформаційних алгоритмів, але пацієнти з діабетом та без нього відрізняються у 18 видів бактерій. Дослідники назвали це явище специфічним для тканини таксономічним бактеріальним сигнатуром, який також корелював із появою запальних маркерів та метаболічних параметрів.
Пітер Ковач, Рима Чакарун та Лукас Массьє розгадали таємницю того, чому жирова тканина багатьох людей із ожирінням запалюється. Фото: Universitätsmedizin Leipzig (зліва); Приватна (середня та права)
Обидві групи пацієнтів також мали бактерії штамів Proteobacteria і Firmicutes у жировій тканині та системно. Зокрема, відомо, що бактерії філумікутів трапляються частіше, ніж в середньому, в кишковому мікробіомі людей з ожирінням. "Ми знаємо, що певні бактерії в мікробіомі кишечника сприяють збільшенню ваги і що склад мікробіома залежить як від генів, так і від нашого способу життя", - говорить Чакароун. Тому дослідники не були здивовані, коли натрапили на ці штами бактерій. Результати не можуть дати відповіді, чи мікроби насправді мігрують через кишкову стінку в навколишні тканини чи вони поглинаються пасивно - як клітинний залишок, так би мовити.
Ось чому для дослідників Лейпцигу було недостатньо шукати в жировій тканині людини фрагменти бактеріальної ДНК. Вони хотіли показати, що насправді в черевній кишці поза кишечником є цілі бактерії. Для цього вони вдалися до методу, який фактично використовується в екологічному аналізі. "CARD-FISH значно більш чутливий, ніж FISH, і ми сподівалися, що зможемо таким чином виявити невелику кількість бактерій у жировій тканині", - говорить Ковач, а Чакарун додає: "Оскільки ми не є експертами з мікробів, у нас є ці тести разом зроблений з Нікуліною Мусат з Центру екологічних досліджень (UFZ) тут, у Лейпцигу ".
Що таке CARD-FISH? Ми знаємо FISH як флуоресценцію in situ гібридизацію, тобто метод гібридизації, при якому мічені флуоресценцією нуклеотидні зонди використовуються, наприклад, для лову додаткової ДНК або РНК на зрізах тканин. У багатьох зразках навколишнього середовища є не лише крихітні скупчення бактерій, вони також добре розподіляються в будь-якій кількості бруду. Це означає, що фонові сигнали часто значно більші за фактичний сигнал флуоресценції зонда. Щоб обійти це, зараз до FISH приєднується CARD, Catalysed Reporter Deposition: класичний зріз тканин для імуногістохімії гібридизується з одноланцюговим зондом ДНК проти еубактерій. Цей зонд містить не флуорофор, а фермент HRP (пероксидазу хрону). У присутності перекису водню пероксидаза перетворює неактивні, мічені флуоресценцією тираміди в радикали тираміду. Вони, в свою чергу, ковалентно зв'язуються з ароматичними бічними ланцюгами - наприклад, тирозином - білків, що знаходяться в безпосередній близькості від HRP. Оскільки цей процес є ферментативним, багато тираміди з часом «радикалізуються».
Замість одного флуорофора на зонд дослідник отримує до 1000 флуоресцентних сигналів з підсиленням сигналу Tyramid (TSA). Таким чином в очі потрапляють навіть найменші сліди бактеріального матеріалу. За допомогою CARD-FISH бактерії можна виявити та визначити кількісно, без необхідності попередньо видаляти або збагачувати їх. І саме цього досягли лейпцизькі дослідники - вони виявили цілі бактерії в жировій тканині людини. Вони також показали, що чим більше бактерій в жировій тканині, тим вищий рівень запалення і хворі пацієнти. Висновок, який Чакарун та Ковач роблять із цих результатів: кількість та склад бактерій у жировій тканині також сприяють запаленню у хворих на цукровий діабет 2 типу та людей із надмірною вагою.
Неясно, як саме бактерії потрапляють у вісцеральний жир. "Кишечник є одним із найбільших інтерфейсів з нашим середовищем", - говорить Чакарун. «Відомо, що певні харчові звички або вживання алкоголю впливають на проникність кишечника». Крім того, деякі бактерії - наприклад, Enterobacteriaceae - виробляють токсичні ліпополісахариди, які також роблять стінку кишечника більш проникною. Таким чином, бактерії кишкової флори можуть легко мігрувати в навколишні тканини або вимитися. "У наступному проекті ми виміряємо кишкову проникність пацієнтів, щоб ми могли також довести це", - говорить Ковач.
Але чи справді достатньо кількох бактерій у жировій тканині, щоб викликати імунну реакцію та зробити людей хворими? Зрештою, дослідники підрахували, що незначна кількість бактеріальної ДНК в жировій тканині приблизно еквівалентна одній бактерії на кожні 100 адипоцитів. Тому в моделі культури клітин вони дратували адипоцити порівнянною кількістю бактеріальної ДНК. І ось ось - клітини відреагували бурею обурення і - залежно від концентрації - випустили маркери запалення IL-6 і TNFα.
Лейпцизькі дослідники планують дослідити більше зразків тканин у майбутньому. "Ми хочемо створити своєрідний біобанк для цього проекту, в якому, звичайно, зберігаються органи контролю для здорових і нормальної ваги випробуваних", - говорить Ковач. Поки це не вдалося через етичні проблеми. Але існує дискусія з клінікою щодо шляхів, якими ще можна буде отримати доступ до здорових тканин.
Однак співавтор дослідження Лукас Массьє поки що не братиме участі в подальших експериментах. "Це дослідження збільшило його ринкову вартість, і тому його прийняли на роботу в Інститут Каролінської в Стокгольмі до того, як він захистив докторську дисертацію", - говорить Ковач. Але навіть там він продовжує працювати над біологією жирової тканини.
Останні зміни: 12.10.2020