Локалізація, ідентифікація та висічення протоколу депо жирового миша (перекладено німецькою мовою)
Резюме
Через різкий та негативний зв’язок між ожирінням та іншими супутніми захворюваннями, дослідження ролі жирової тканини у захворюванні та загальному стані здоров’я є необхідним. Ми представляємо протокол виділення та видалення депо жирової тканини, що дозволяє вивчати жирову тканину методами in situ та in vitro.
Вступ
Ожиріння помітно з’явилося в центрі уваги ЗМІ через різке збільшення ожиріння в останні десятиліття 20 століття. В даний час ожирінням страждає більше третини дорослих та 17% дітей та підлітків у Сполучених Штатах (США) 1. Статистичні дослідження навколо епідемії ожиріння серед усіх національностей показали, що неіспаномовні чорношкірі мають найвищий коефіцієнт ожиріння з урахуванням віку (49,5%) порівняно з американцями-мексиканцями (40,4%) серед усіх латиноамериканців (39,1%) та неіспаномовних білих (34,3%). 2. Економічний вплив ожиріння також зростає інтерес до системи охорони здоров'я. У 2012 році було підраховано, що щорічні витрати на медичну допомогу в США за ожирінням у 2005 р. Становили 190,2 млрд. Дол. На жаль, за оцінками, ожиріння серед дітей лише на прямі медичні витрати призвело до 14 мільярдів доларів. Статистично було встановлено, що середні медичні витрати людей із надмірною вагою на 2741 долар США на рік перевищують показники захворюваності без цієї 3-5 захворюваності.
Ожиріння є важливим фактором ризику для різних захворювань, таких як: діабет 2 типу, порушення ліпідного обміну, серцево-судинні захворювання, рак, опорно-руховий апарат та хронічне запалення. Ожиріння глибоко пов'язане з патогенезом метаболічного синдрому та інших хронічних захворювань 6-8. Маючи такі різкі та негативні зв’язки між ожирінням та іншими супутніми захворюваннями, наукові дослідження зосередили увагу на сучасній епідемії та різноманітній та вирішальній ролі жирової тканини для кращого розуміння.
Історично жирова тканина вважалася незначною і розглядалася як проста тканина, що заповнює. В даний час показано, що жирова тканина відіграє багато важливих ролей у функції організму: обмін речовин, гормональний баланс, запалення, захист та ізоляція 9. Жирова тканина складається переважно з адипоцитів, але також містить перицити, ендотеліальні клітини, моноцити, макрофаги та плюрипотентні стовбурові клітини 8. Жирова тканина складається з розподіляються по тілу в різних депо. Основні депо можна знайти підшкірно, підшкірно, внутрішньом’язово та вісцерально. Депо, як показали жирові депо, має специфічні для депо профілі речовин, які демонструють специфічну схильність депо до ожиріння та пов’язаних з цим розладів 8.
Традиційно жирова тканина класифікується на два основних типи: білу жирову тканину (WAT) і коричневу жирову тканину (BAT); хоча недавня література свідчить про присутність третьої групи хрещених бритів або бежевих жирових тканин 11. Показано, що жирова тканина має різні кольори, пов’язані з морфологіями, метаболічними функціями, біохімічними властивостями та особливостями генетичної експресії 10. Адипоцити в WAT - це одна, велика крапля жиру та мітохондрії зі змінною кількістю. WATдомінант виявляється в підшкірних та вісцеральних відділах тіла. ВАТ діє насамперед як місце зберігання енергії та захисту органів. Адипоцити в БАТ мають мультилокулярну морфологію та рясні мітохондрії. BAT головним чином розташований у шиї та великих кровоносних судинах грудної клітини, а також у 12 лопатках. BAT головним чином функціонує в енергоємних способах поведінки, які регулюють термогенез 7. Британська або бежева жирова тканина демонструє аналогічну морфологію та експресію BAT, але, як було показано, виникає з білих жирових клітин 11.
Метою протоколу є надати точний метод ідентифікації та ізоляції різних типів жирових відкладень з багатьох анатомічних ділянок.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
ПРИМІТКА: Усі випробування на тваринах проводились із схвалення Інституційного комітету з догляду та використання тварин (IACUC) Університету Цинциннаті та відповідно до Національного керівництва інститутів охорони здоров’я щодо догляду та використання лабораторних тварин (публікація NIH 85-23, Переглянуте 1996).
1. Евтаназію та стерилізацію миші
- Помістіть мишу в коробочку, виготовлену з надтерапевтичної дози ізофлурану, і дайте ефекту вдихнути. Після того, як миша вбита, видаліть її з поля.
- Зміщення шийки матки як другий засіб евтаназії.
- Стерилізуйте зовнішню поверхню миші, очищаючи тварину 70% етанолом.
2. Ідентифікація та виділення трьох різних депо жирової тканини
3. Виділення периваскулярної жирової тканини (PVAt)
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Ідентифікація та локалізація пахової підшкірної жирової клітковини, міжлопаткової коричневої жирової тканини, вісцеральної жирової тканини придатка яєчка (Ілюстрація 1) а також дуга аорти, периваскулярна жирова тканина, жирова тканина грудної аорти, сусідня жирова тканина аорти та інфраренальна жирова тканина (Малюнок 2) було успішно досягнуто з використанням описаного хірургічного методу. Гістологічне дослідження та диференціація зразків BAT та WAT були позитивними при фарбуванні гематоксиліном та еозином (H&E) (Малюнок 3) оцінено. Аналіз РНК-адипонектину (ADIPOQ), гамма-рецептора, що активується проліфератором пероксисоми (PPAR-γ), індукуючий DFFA-подібний ефектор a (CIDEA) та інших специфічних для жиру маркерів вимірювали для всіх вищезазначених ізольованих та вирізаних депо (дані не наведені).
Первинні клітинні лінії з підшкірно-жирових клітин та периваскулярних адипоцитів культивували та диференціювали від преадипоцитів до адипоцитів для успішного аналізу мікрочипів. Культивовані преадипоцити перетворювались на адипоцити з олійно-червоним фарбуванням O (Малюнок 4) затверджено. Успішного виділення, культивування та диференціювання жирових клітин було досягнуто для використання в дослідженнях in vitro та успішно виміряно активність білка. Ферментативну активність матриксної металопротеази-2 (ММП-2) вимірювали в групі лікування порівняно з контролем. Активність MMP-2 визначали in situ у первинній периваскулярній лінії адипоцитів за допомогою зимографії (Малюнок 5) виміряний.
Обговорення
Ожиріння може призвести до широкого спектру супутніх захворювань, і повне розуміння ролі, яку відіграє ожиріння, не до кінця зрозуміле; отже, необхідні подальші дослідження в галузі ожиріння. Тваринні моделі, особливо мишачі, ідеально підходять для попереднього дослідження прогресування захворювання та тестування потенційних фармацевтичних методів лікування. При використанні цих моделей точне відокремлення та видалення відкладень жирової тканини є надзвичайно важливим і необхідним інструментом при вивченні патології жирової тканини, що вражає захворювання.
У сучасній літературі, що стосується відкладень із ожирінням, є значна кількість літератури про метаболічну поведінку та відмінності між відкладеннями ожиріння та їх анатомічним розташуванням. Однак мало хто пропонує детальний метод, як конкретно знайти, ідентифікувати та ізолювати ці склади. На основі огляду поточних процедур ізоляції з жирової тканини існує невелика підмножина протоколів tcap, яка надає методологію того, як ізолювати одне або два депо за раз. Однак точною технікою, яка дозволяє ізолювати кілька складів з мінімальною кількістю підготовки та забруднення, а також розглядає різні методи дослідження зібраних зразків, є цей Протокол 13-14.
У рамках цього методу існує кілька етапів, які мають вирішальне значення для ізоляції та чистоти зразка. Чищення інструментів, рукавичок та поверхонь, часто для видалення волосся та сміття, є обов’язковим кроком для уникнення забруднення депо. Розрізаючи шкіру по всьому периметру миші, щоб викрити очеревину для глищення, важливо не пускати щось глибоко. Різання очеревини дуже ускладнить дегловінг та збільшить потенціал забруднення зразка. При вирізанні депо жирової тканини SQ важливо визначити трикутні межі депо перед тим, як вирізати будь-яке з жирової тканини. Також порізи слід робити обережно, щоб уникнути м’язів та сусідніх судин, залоз та жирової тканини. Це запобіжить забрудненню зразка альтернативною жировою тканиною, залозистою тканиною, м’язами або кров’ю.
Основне обмеження до ізоляції та висічення депо жирової тканини в цій процедурі та інших подібних процедурах можна знайти у визначенні меж певних депо. Через погано визначені межі депо, наприклад підшкірних депо, виділення невеликої кількості домішок із сусіднього жиру може бути ускладненим. Ще одне обмеження може бути знайдене у забезпеченні збору достатньої кількості тканин у судинних депо для додаткових спроб. Це обмеження іноді вимагає об’єднання зразків, хоча це залежить від місця ізоляції та раціону, пов’язаного з твариною.
Після виділення депо жирової тканини їх можна використовувати для різних аналізів. Жирова тканина може бути використана для молекулярних досліджень, таких як експресія білка, активність ферментів та аналіз експресії генів. Крім того, адипоцит може ізолювати первинну клітинну лінію в дослідженнях in vitro. Безсмертні клітинні лінії також можуть бути використані для досліджень in vitro, однак безсмертні клітини не настільки надійні, як насамперед окремі клітинні лінії. Нарешті, жирова тканина може бути твердою або замороженою в ОКТ для гістологічного дослідження для виявлення лейкоцитарної інфільтрації, локалізації білка та характеристики морфології адипоцитів.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.