Методи очищення білка; Новини-Медичні
Застереження: Ця сторінка є автоматичним перекладом цієї сторінки спочатку англійською мовою. Зверніть увагу, оскільки переклади створюються машинно, не всі переклади будуть ідеальними. Цей веб-сайт та його веб-сторінки призначені для читання англійською мовою. Будь-який переклад цього веб-сайту та його веб-сторінок може бути неточним і неточним, повністю або частково. Цей переклад подано на практиці.
Технології білкової інженерії є важливою частиною налаштування або отримання білків зі специфічними властивостями, які можуть застосовуватися в різних промислових процесах. Тому вони є важливими для біотехнологічних досліджень.
Однак ці методи значною мірою залежать від можливості виділити та очистити бажані білки, щоб можна було зрозуміти їх матеріальні та хімічні властивості, а також їх третинну структуру та взаємодію з лігандами та субстратами.
Інтенсивність, з якою продовжується цей процес очищення, залежить від використання білка. Наприклад, фармацевтичні та харчові білки повинні бути доведені до високого ступеня чистоти і пройти кілька послідовних етапів, лише можливих, оскільки з кожною операцією певний білок неминуче буде знищений.
Очищення молекул білка простіше, ніж очищення білкових сполук.
Крок 1: Виробляють сирий білковий екстракт
Сирі екстракти внутрішньоклітинних білків готують шляхом лізису клітини хімічними або механічними методами. Потім бруд видаляється центрифугуванням. Надання правильного супернатанту - це далеко не чиста форма, воно змішується з багатьма іншими макроінструкціями та мікромолекулами.
Позаклітинні білки отримують шляхом центрифугування розчину та видалення клітин. Конкретним методом отримання сирого екстракту термостабільних ферментів є нагрівання суміші для денатурації інших білків, а потім охолодження, щоб поглинути цікаві термостабільні білки, нарешті, центрифугуючи для видалення денатурованих білків.
Крок 2: Проміжне очищення
Соління
Потім білки в неочищеному екстракті очищають осадженням їх з висококонцентрованого розчину солі, такого як сульфат амонію. Це працює на основі меншої розчинності білка при високій концентрації солі. Однак не всі білки випадають в осад при однаковій концентрації солі, а це означає, що соління також сприяє розщепленню білків. Також його можна використовувати для концентрування білків у розчині. Ця операція збільшує чистоту втричі, і 92% білка в розчині відновлюється.
Діаліз
Білки - це великі молекули, і це означає, що солі білка будуть підтримуватися шляхом пропускання розчину через напівпроникну мембрану. Целюлоза - типова мембрана для діалізу. Діаліз не можна використовувати для розділення білків з різною молекулярною вагою.
Хроматографія
Інші методи, що застосовуються для видалення солених білків із зовнішнього середовища, включають хроматографію та фільтрування гелем. Зараз вони доступні як готові набори для багатьох нормальних білків і часто підходять для процесів високої потужності.
Гель-фільтрація працює на основі поділу розмірів колоною з пористих полімерних гранул, таких як декстран або агароза. Великі молекули можуть проходити лише через проміжки між п’ятами, тоді як менші займають ці два простори та простір усередині п’ят, уповільнюючи їх. Таким чином, елюенти містять молекули, розташовані в порядку їх розміру, від більших до менших. Також застосовуються зворотно-фазові або іонообмінні методи хроматографії, що діють на основі диференціальних гідрофобних властивостей і заряду відповідно. Хроматографія з зворотною фазою може бути обмежена у застосуванні через можливу денатурацію білка органічними розчинниками.
Діаліз та іонний обмін дають розчин, який є в 9 разів чистішим, але в даний час доступно лише 77% вихідного білка. Після гель-хроматографії виключення потенція становить лише 50%, але чистота в 100 разів.
Крок 3: Остаточне очищення
Афінна хроматографія
Цей метод залежить від використання лігандів, зв’язаних з п’ятами, які особливо зв’язуються з цікавим білком, який потім можна змити іншим розчином вільних лігандів. Це призводить до надзвичайно чистих зразків білка, які мають найвищу питому активність серед усіх загальноприйнятих методів. Одним із прикладів є очищення конканаваліну А з використанням залишків глюкози, прикріплених до п’ят в колонці. Розчин тепер чистіший у 3000 разів, але ефективність становить лише 35% від вихідного білка.
Електрофорез у поліакриламідному гелі
Електрофорез у поліакриламідному гелі використовується для визначення чистоти зразка білка після кожного циклу на основі розміру. Чистий заряд на молекулі змушує її опускати колонку або гелевий лист в електричне поле, що дає можливість відокремлювати білки на основі їх швидкості переносу, яка, в свою чергу, залежить від їх заряду, а також від тертя та напруженості поля . Гель діє як хімічно інертний і легко формується фільтр, при цьому молекули білка майже не рухаються в колонці, оскільки вони застряють між набагато меншими порами між молекулами в гелі. На початку показана серія смуг, які представляють різні білки в суміші, які поступово зменшуються, поки остаточна операція не покаже лише одну смужку.
Імунопринт
Ще одна корисна техніка, яка часто поєднується з афінною хроматографією, - це імуноблотинг. Він використовує антитіла, щоб виділити білок як ліганди в чумі. Іноді антитіло приєднують до ізотопів або барвників для їх мічення та полегшення скринінгу після поділу.
Будь-яка хроматографічна техніка вдосконалюється за допомогою тиску, щоб проштовхувати розчин через колонку з тонкоподрібненими матеріалами, незалежно від того, завантажені вони або металізовані ліганди. Збільшена площа поверхні призводить до більшої взаємодії, що збільшує чіткість і швидкість техніки. Це називається високоефективною рідинною хроматографією (ВЕРХ).
Всі ці операції включені в Ідеальний план, який повинен зосередитися на рівнях потенції та рівня очищення, щоб доставити адекватну кількість білка для проходження експерименту, а також забезпечити достатню чистоту, щоб зробити оцінку відносно прямою.
Список літератури
Подальше читання
Доктор Ліджі Томас
Доктор Ліджі Томас - лікар-гінеколог, який закінчив Урядовий медичний коледж Університету Калікута, штат Керала, в 2001 році. Лідзі кілька років після закінчення навчання працювала штатним консультантом з акушерства/гінекології в приватній лікарні. . Вона консультувала сотні пацієнтів, які стикаються з проблемами, пов'язаними з вагітністю та безпліддям, і відповідала за понад 2000 пологів, намагаючись завжди досягти нормальних пологів, а не оперативних.
Цитати
Будь ласка, використовуйте один із наступних форматів, щоб цитувати цю статтю у своєму есе, роботі чи доповіді:
Томас, Лідзі. (2019, 26 лютого). Методи очищення білка. Новини-Медичні. Отримано 03 лютого 2021 року з https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.
Томас, Лідзі. "Техніка очищення білка". Новини-Медичні. 03 лютого 2021 року. .
Томас, Лідзі. "Техніка очищення білка". Новини-Медичні. https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx. (доступ 03 лютого 2021).
Томас, Лідзі. 2019. Методи очищення білка. News-Medical, переглянутий 03 лютого 2021, https://www.news-medical.net/life-sciences/Protein-Purification-Techniques.aspx.
News-Medical.Net надає цю медичну інформаційну послугу відповідно до цих умов. Зверніть увагу, що медична інформація, розміщена на цьому веб-сайті, призначена для підтримки, а не для заміщення стосунків між пацієнтом та лікарем/лікарем та медичної консультації, яку вони можуть надати.
News-Medical.net - Сайт AZoNetwork