Мікрокосми з агарного блоку для контрольованого розкладання рослинних тканин за протоколом аеробних грибів
Резюме
Це відео демонструє підхід до вивчення контрольованого середовища деградації тканин лігноцелюлозних рослин аеробними грибами. Можливість контролювати джерела поживних речовин та вологи є однією з головних переваг агарного блоку мікросвіту, але підхід часто дає неоднозначні результати. Ми розглядаємо критичні підводні камені щодо відтворюваності врожаю, низької мінливості результатів.
Анотація
Тут ми використовуємо руйнівний гриб деревної бурої гнилі Serpula лакримани для деградації деревини в агарі мікрокосму, використовуючи чашки Петрі з невеликою глибиною кальцієвого агару. Ми перевіряємо роль екзогенних факторів на розкладання гіпсу в часових рядах, щоб продемонструвати корисність та очікувану мінливість. Поодинокі ребра RIP (поздовжній зріз) упаковують, зважують, автоклавують і асептично вводять у верхню пластикову сітку. Грибні щеплення є на кожній стороні блоку, а екзогенний гіпс доданий до поверхонь. Посіви асептичні до остаточного руйнівного врожаю. Ці мікрокосми призначені для уникнення контакту з агаровими блоками або стінками чашки Петрі. Конденсація зводиться до мінімуму, коли пластина виливається та під час інкубації. Нарешті, відстань між посівними матеріалами/штукатуркою/деревиною зведено до мінімуму, але не допускаючи контакту. Ці менш технічні аспекти проектування агар-блоків є також найпоширенішими причинами невдач та основним джерелом мінливості між дослідженнями. Тому відео публікація корисна в цьому випадку, і ми демонструємо низьку варіативність та високу якість результатів.
Протокол
Цей протокол поширюється на деревні та недерев'яні основи, як зазначено, а також на піч або сушений на повітрі матеріал. Однак перед початком налаштування прочитайте протокол. Існує кілька піднятих моментів, які можуть стосуватися Вашого дослідження, і ці пункти (підкреслені) потребують планування. Зауважимо також, що іноді застосовуються два опубліковані агароблокові методи, один із Британського стандарту 838, а інший - за документом Міжнародної дослідницької групи з захисту деревини (IRG-WP), представленим Bravery (1978). Наш метод нагадує 838, з адаптацією, головним чином, в мікрокосмічному дизайні та контролі агару, але знову ж таки, обох підходів часто уникають через історичні проблеми контролю вологи в деревних блоках, що спричиняє аноксию та мінливість. Хороший огляд цих методів випробувань, що включає обговорення конструкцій агар-блоків, включаючи стандарт 838, можна знайти в роботі Nicholas (1973).
1) Підготовка мікросвітів
Мікрокосми для цих випробувань на 1 см вищі (глибші), ніж типові чашки Петрі, що збільшує простір голови над деревними блоками. Вони наповнені скромною і точною кількістю агару, щоб контролювати абсолютну кількість поживних речовин, крім їх концентрації, і тримати дерев’яні бруски подалі (> 3 мм) від кришки. Агар, що застосовується у цьому випадку на гіпсовому тестуванні, є різновидом слабкого кальцієвого агару; однак ми демонструємо репрезентативні результати із використанням середовища Блекслі, середнього значення ATCC, рекомендованого для підтримання аналізу для виділення Serpula lacrymans (Wulfen: Fries) Штам Шретера APEM 65 (ATCC 32750).
Ця конструкція захищає рослинні тканини від контакту агару та захищає від плоского покриву та стінок. Змінне змочування лігноцелюлозних субстратів є основним джерелом мінливості в аналізах агар-блоків. Зволоження для збільшення вологості створює аноксію і пригнічує або навіть зупиняє аеробне біологічне розкладання. Це також створює проблему для тих, хто вивчає окислювальні механізми грибів бурої та білої гнилі, відповідальних за гниття деревини. Конденсат на кришках плити є проблемою, якщо краплі води вільно утворюють і змочують основу. Подібним чином, деревина та інші тканини швидко "виводять" воду з агару при контакті, що призводить до вмісту води понад 80% (суха маса. Основа) і зупиняє аеробну деградацію. Тканини слід тримати подалі від цих джерел води, дозволяючи нитчастому грибку знаходити, підключати та контролювати вологу в субстраті.
(Примітка. Доцільно застосовувати альтернативні середовища, особливо з мінімальною кількістю солей, що додають поживний агар, спочатку переконайтеся, що ваш тест-гриб буде рости на ньому, оскільки високі іонні сили можуть стримувати ріст або навіть вбити ваш тест на ізолят) Використовуйте переносну піпетку для допомоги та 10-мілілітрові стерильні пістирольні піпетки для асептичного перенесення агару в шафу біологічної безпеки. Дозволити носіям охолоджуватися тут важливо, щоб мінімізувати конденсацію. Крім того, складайте тарілки високо по мірі заливки, щоб мінімізувати вільну воду на кришках. Хоча конденсація є неприємністю для звичайного вирощування, вона представляє головну проблему, якщо ДРО формують Плетс та змочують деревину. Вміст вологи (MC) понад 80% (суха маса) створить аноксію в тканинах, обмежить деградацію аеробними грибами та збільшить мінливість. Розрахуйте MC наступним чином:
MC * = [(свіжа вага х суха вага)/суха маса] x 100
2) Приготування основи «Блок»
Ці протоколи були розроблені для твердої деревини, але пристосовані для інших рослинних тканин. Втрата маси є стандартним показником прогресу гнилі в деревині, деградованій ниткоподібними грибами. Таким чином, наш підхід використовує безводну вагу до і після карієсу для визначення втрати маси. Однак для будь-яких досліджень біоенергетики, де основна увага приділяється хімії рослинної тканини, багато хто вважає, що тканина, що сушить повітря, є кращою. Тут ми показуємо протоколи для підготовки ваших культур з агарних блоків до використання висушеного в духовці вихідного матеріалу, але даємо альтернативну інформацію для сухого на повітрі, а також для обробки порошку замість твердих субстратів.
Корекційний коефіцієнт MC = суха маса/свіжа вага
Приклад: 2,46 г (сухий)/2,68 г (свіжий) = 0,918; таким чином, блок 3,0 г свіжого - 2,75 г висушеного в духовці
3) Інокуляція та маркування
Інокуляція мікрокосмів агар-блоком вимагає більше часу, ніж інокуляція ґрунтових блок-вазонів. Для нас ми розраховуємо на те, що кожне щеплення займе 3 хв. Для чашок Петрі, що містять агар, це точка додавання для решіток, деревини, усіх поживних речовин з екзогенних джерел (тут гіпсові гранули) та грибка. Збільшується ймовірність забруднення через кількість часу, коли кришка відкрита, і кількість відвідувань інтер’єру. Є також кілька ключових помилок, які часто допускаються в цей момент, і їх найкраще викрити, поєднавши відео з текстом. Перегляньте відео.
4) Інкубація та збір врожаю
Пластини можна інкубувати залежно від вашого грибка, але їх слід по можливості зберігати в біологічному інкубаторі, щоб уникнути конденсації внаслідок коливань температури. Динамічні ряди - це врожай, проведений асептично, за винятком останнього врожаю. Якщо ці проміжні врожаї зроблені після значного зростання на субстратах, обробка плит простіша, тому що субстрати зшивання гіф.
Втрата маси% = [(початкова вага кінцева вага)/початкова вага] x 100
- Альтернатива сушіння на повітрі: якщо вам потрібно висушити на повітрі, з метою подальшої біологічної обробки матеріалу, вам слід використовувати режим кондиціонування з розділу 2.3 для перепакування. Якщо вам потрібно визначити втрату маси, для цього потрібно буде виміряти вміст вологи, одним із рішень є розділення блоків (або порошків) на малу та велику порції. Зважте обидва, але невелику порцію висушіть лише в духовці. Розрахуйте коефіцієнт перетворення вологи, як зазначено вище, а потім застосуйте його до загальної маси свіжих малих + великих порцій (загальної ваги свіжих блоків). Особливо якщо попередня обробка матеріалу грибком перед оцукрюванням або іншими процесами втрати маси допоможе вам пізніше визначити баланс маси та підрахувати вуглеводи, спожиті грибом.
5) Інтерпретація результатів
Лігноцелюлозна тканина, як правило, повільніше знижує показники агар-блоків, але в цей момент у вас повинна бути відносно низька мінливість, навіть при помірному рівні розпаду. Ви також повинні мати помірну (20-50%) вологість не високу в контрольних тканинах.
Стандартизована концентрація = ммоль/gx [1 - (втрата маси%/100)]
Приклад: 10 ммоль/г Ca у деревині, що погіршується на 20%, проти 7 ммоль/г у нульовий момент часу.
Питання: Чи збільшився вміст Са під час розпаду?
10 ммоль/г - це очевидний приріст на 3 ммоль/г, приріст на 43%, але ограмовий NE з деревного порошку низької щільності з градієнтами зараз представляє більший обсяг. Стандартизація необхідна для порівняння початкового та кінцевого вмісту Са з однаковими обсягами деревини.
10 х [1 х (20%/100)] = 8 ммоль/г нормалізовано
Відповідь: Так, вона зросла, але на 14%, а не на 43%.
(Дані також можна виразити як об'єм деревини, ммоль/см 3, помноживши на щільність.
Малюнок 2. Серпула-лакримани колонізують блоки соснової деревини, що спираються на пластикову сітку, щоб підняти блоки над контактним агаром. Цей міцелій представляє важливий зв'язок між деревиною та екзогенними джерелами поживних речовин/елементів, і контроль над цими екзогенними джерелами речовин в агарі або у вигляді твердих матеріалів є однією з головних переваг конструкції агароблоків перед конструкцією грунтових блоків.
Малюнок 3. Середня втрата ваги%, як показник ступеня гниття деревини лакриманами Serpula після інкубації 5 та 15 тижнів із соснами в мікрокосмічному агарному блоці. Обробка не проводилась (без вмісту Ca), 5 мМ CaCl2 додавали до агару (CaCl 2), чистота> 99% гіпсу (CaSO 4), тобто 1% гіпсу, модифікованого залізом. Захищений ANOVA означає, що для порівняння використовували тести Тукі, з α = 0,05. Для кожного врожаю бруски в одній букві суттєво не відрізняються. Смуги помилок = стандартне відхилення. Опубліковано в Шилінгу (2010).
Малюнок 4. Аерофотознімок (А) усіх п’яти повторень на 15 тижні тестового розпаду тим самим грибом коричневої гнилі, сльозотечами Серпула, а також видаленими блоками (В) та висушеними в печі. Зверніть увагу на відсутність безметанічної обробки без вмісту Са, пожовтіння чистого кальцію та появу іржі при застосуванні із зміненим залізом. Процедури позначені як на малюнку 3, причому блок контролю (B) не посів для порівняння.
Малюнок 5. Аерофотознімок іншого тесту із застосуванням заліза із середньою концентрацією, солодового агару Блекслі. Зверніть увагу на втрати меланізації, що спостерігаються, порівняно з малюнком 4. Вилучені та зважені блоки не показали ефекту лікування на втрату ваги. Це представлено як демонстрація впливу екзогенних компонентів цих блокових тестів. Ці ефекти не можна перевірити в глиняних конструкціях горщиків, де ці екзогенні входи надто важко контролювати.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
За допомогою нашого розміщення агарних блоків (рис. 1) лакримани серпули росли в безпосередньому контакті з штукатуркою та поверхнями дерев’яних блоків (рис. 2), що призвело до втрати ваги понад 60% у контролі за гнило-бурими сосновими блоками (рис. 3). Це легко відповідає цілі ASTM щодо розкладання> 50%, а середній коефіцієнт варіації (CV) при розкладанні становив 0,055 на 16-му тижні. Ці дані опубліковані в Schilling 7. Знову ж таки, для інших грибів потрібно буде триваліша інкубація в агар-блоці ніж у грунтовому блоці. Для довідки ми успішно виконали подібні конструкції в кількох минулих експериментах з різними видами грибів, часто використовуючи скануючу електронну мікроскопію, дисперсійну спектроскопію (SEM-EDS) та індуктивну плазмову спектроскопію (ICP-OES) для перевірки зв’язку з екзогенними субстратами і транслокація кальцію та інших елементів у деревині 8,9.
У сукупності ці результати та відсутність ефектів від обробки залізом із високим вмістом агару є дуже вагомою демонстрацією контролю, який конструкція блоку агарних блоків може надати досліднику, особливо у світлі альтернативи.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.