Mir-146a-5p пригнічує активацію і проліферацію печінкових зірчастих клітин у

печінкових

  • Теми
  • Анотація
  • вступ
  • Результати
  • Диференціальна експресія мікроРНК печінки у мишей з фіброзуючим стеатогепатитом
  • Аналіз генної онтології та аналіз шляхів мікрочипів ДНК для диференційовано експресованих мікроРНК
  • Валідація експресії мікроРНК за допомогою кількісної ПЛР у реальному часі (qRT-PCR)
  • miR-146a-5p було врегульовано в HSC увімкнено в пробірці
  • Надмірна експресія miR-146a-5p пригнічувала проліферацію HSC
  • Вплив miR-146a-4p на активацію HSC та осадження колагену
  • miR-146a-5p діє безпосередньо на 3'UTR мРНК Wnt1 та Wnt5a
  • miR-146a-5p Wnt1 та Wnt5a регулюються на рівні посттранскрипції
  • Вплив надмірної експресії та інгібування miR-146a-5p на гени-мішені за течією сигнального шляху Wnt
  • Нокдаун Wnt1 або Wnt5a пригнічував експресію генів передачі сигналів Wnt і фіброгенезу
  • Обговорення
  • Методи
  • Моделі тварин на безалкогольному фіброзуючому стеатогепатиті
  • Гістологічний аналіз та біохімічний аналіз
  • Аналіз мікрочипів
  • QRT-ПЛР-аналіз
  • Ідентифікація потенційних мішеней гена miRNA
  • Виділення, культура та ідентифікація HSC
  • трансфекція miR-146a-5p у HSC
  • Втручання та трансфекція РНК
  • Імуноцитохімічний аналіз
  • Тест на проліферацію клітин
  • Вестерн-блот-аналіз
  • Аналіз активності люциферази
  • статистичний аналіз
  • Додаткова інформація
  • Додаткова інформація
  • Файли PDF
  • Додаткова інформація
  • коментарі

Теми

  • Фіброз печінки
  • Безалкогольна жирова хвороба печінки

Анотація

вступ

Безалкогольний стеатогепатит (НАСГ) є частиною спектру неалкогольного жирового печінкового стеатозу (НАЖХП), що характеризується стеатозом, часточковим запаленням та прогресуючим перицелюлярним фіброзом 1. При тривалому ураженні печінки стеатогепатит може перерости у фіброз печінки, пов’язаний із надмірним накопиченням позаклітинного матриксу (ECM). Печінкові зірчасті клітини (HSC) відіграють центральну роль у патогенезі фіброзу печінки 2. HSC, що відпочиває, може бути активований у відповідь на хронічний стеатогепатит 3. Активовані HSC стимулюють вироблення колагену та накопичення ECM, що призводить до розвитку фіброзу печінки 4. Незважаючи на фундаментальний прогрес у розумінні патофізіології безалкогольного фіброзуючого стеатогепатиту, механізми фіброгенезу при наявності стеатогепатиту залишаються незрозумілими.

Результати

Диференціальна експресія мікроРНК печінки у мишей з фіброзуючим стеатогепатитом

Як показано на малюнку 1, ділянки печінки мишей, які харчувались МКД дієтою, мали невпорядковану структуру часточок, макростеатоз в зоні 3, локалізований або вогнищевий гепатоцитарний некроз, запальну інфільтрацію та перисинусоїдальний фіброз (рис. 1А). сироватка. та рівні AST (P 2 рази) (рис. 1C).

( AT ) Гістопатологічні зміни на зрізах печінки у мишей, що годували МКД дієтою, і фарбований контроль гематоксиліну та еозину (вгорі) та трихроматизм Массона (внизу). ( ) Вплив дієти MCD на рівень АЛТ та АСТ у сироватці крові. ( VS ) Різнорегульовані мікроРНК, ідентифіковані мікрочипом мікроРНК. ( D ) Перевірка даних мікрочипів ДНК за допомогою RT-PCR в реальному часі. Триразові аналізи проводили для кожного зразка РНК, і відносна кількість кожної міРНК нормалізувалась до U6 snRNA. Значення є середніми ± SD, ** P

( AT ) Аналіз категорії GO, заснований на прогнозованих цілях всіх диференційовано регульованих мікроРНК. Вертикальна вісь представляє категорію GO, а горизонтальна - збагачення GO. ( ) Аналіз шляху для диференційовано регульованих міРНК. Від кожної миші збирали лише смуги з P 6 CSH. Методом виключення трипанового синього було визначено, що чистота свіжоізольованих живих ГСК перевищує 95%. Імунофлуоресцентне фарбування α-SMA, маркера для активації HSC, показало значне збільшення первинно активованих HSC in vitro (рис. 3А). Було показано, що експресія miR-146a-5p сильно регулюється вниз в активованих HSC (Рисунок 3B).

( AT ) Репрезентативні морфологічні зображення та імуноцитохімічне фарбування активованих та спокійних HSC для десміну та α-SMA (400 ×). Вираз ( ) miR-146a-5p досліджували за допомогою qRT-ПЛР у режимі реального часу. Значення є середніми ± SD, ** P # P

( AT ) Фарбування Desmin, що вказує на проліферацію клітин LX-2 та HSC-T6, зменшується при надмірній експресії miR-146a-5p. ( ) miR-146a-5p пригнічував ріст клітин LX-2 та HSC-T6, як визначали аналізи CCK-8. Значення є середніми ± SD, * P

( AT, VS ) потенційні сайти зв'язування miR-146a-5p на 3'UTRs Wnt1 та Wnt5a. ( , D ) Клітини HEK-293T трансфікували репортерним вектором люциферази, що містить дикий тип або мутантну форму 3′UTR Wnt1 та Wnt5a, у присутності імітаторів miR-146a-5p, імітуючий контроль, miR-146a. -5p-інгібітор та інгібуючий контроль, потім оцінювали активність репортера люциферази через 48 годин після трансфекції. Значення є середніми ± стандартне відхилення, * P # P # P ## P

( AT ) рівні мРНК та білка ( ) β-катенін, GSK-3β та NFAT5 у мишей, які годували печінку дієтою MCD та у контролі. ( VS ) HSC-T6 трансфікували інгібітором miR-146a-5p або інгібітором контролю, імітуючи miR-146a-5p або міметичним контролем протягом 48 годин. Рівні мРНК та білка ( D ) β-катенін, GSK-3β та NFAT5 аналізували за допомогою RT-PCR у реальному часі та вестерн-блот відповідно. Control-актин використовували як контроль навантаження. Значення є середніми ± SD, ** P

На закінчення ми ідентифікували печінкові мікроРНК та оцінили профілі їх експресії при безалкогольному фіброзуючому стеатогепатиті, індукованому дієтою MCD за допомогою мікрочіпу. Серед перевірених miRNAs miR-146a-5p був сильно знижений при безалкогольному фіброзуючому стеатогепатиті та в активованих HSC. Надмірна експресія miR-146a-5p сприяла розвитку фіброзу печінки шляхом інгібування проліферації, активації HSC та депонування колагену, пригнічуючи сигнальний шлях Wnt. Отже, miR-146a-5p може служити новим регулятором у патогенезі безалкогольного фіброзуючого стеатогепатиту.

Методи

Моделі тварин на безалкогольному фіброзуючому стеатогепатиті

Вісім тижнів самців мишей C57BL/6J були виведені і розміщені, як описано раніше. Безалкогольний фіброзуючий стеатогепатит був спричинений годуванням мишей дієтою MCD (Research Diets, Inc., Нью-Джерсі, Нью-Брансвік, США) протягом 8 тижнів. Протягом цього часу мишам годували дієту, доповнену холіновим бітартатом та DL-метіоніном (Research Diets, Inc., Нью-Джерсі, Нью-Брансвік, США) в якості контролю. В кінці експерименту всіх тварин забивали під наркозом і відбирали зразки крові з стегнової артерії для біохімічного аналізу. Печінки частково фіксували в 10% формаліні для гістологічного аналізу або заморожували в ліпідному азоті, потім зберігали в морозильній камері при -80 ° C до бажаного. Усі протоколи та процедури виконувались відповідно до керівних принципів Комітету з догляду та використання лабораторних тварин Хебея та були затверджені Комітетом з етики для експериментів на тваринах Медичного університету Хебея.

Гістологічний аналіз та біохімічний аналіз

Зрізи печінки, закріплені парафіном (товщиною 5 мкм), пофарбовані гематоксиліном та еозином та трихроматизмом Массона, були відзначені при печінковому стеатозі, запаленні та фіброзі, як описано раніше відповідно до критеріїв Брунта та Гістологічної системи оцінки NAFLD, опублікованих Клінічним дослідженням неалкогольного стеатогепатиту Комітет мережевої патології. Рівні ALT та AST у сироватці крові вимірювали ферментативно-кінетичним методом за допомогою автоматичного біохімічного аналізатора (Olympus AU2700, Японія), відповідно до інструкцій виробника.

Аналіз мікрочипів

Загальну РНК витягували з 20 мг тканини печінки у мишей, яких годували дієтою MCD, і мишей, які годували контрольну дієту (n = 3 миші/група), використовуючи реагент TRIzol (Invitrogen) згідно інструкцій виробника. Аналіз мікрочипів мікроРНК μParaflo ™ проводили за допомогою постачальника послуг (LC Sciences, Х'юстон, Техас, США). Аналіз починали з 4 до 8 мкг загальної проби РНК, розширювали на 3 'з полі (А) хвостом, використовуючи полі (А) полімеразу. Потім олігонуклеотидну мітку зв’язували з полі (А) хвостом для подальшого фарбування флуоресцентним барвником. Гібридизацію проводили протягом ночі на мікрофлюїдному чіпі µParaflo з використанням мікроциркуляційного насоса (Atactic Technologies). Після гібридизації РНК мітка, що кон'югує барвник Cy3, циркулювала через мікрофлюїдний чіп для фарбування барвника. Флуоресцентні зображення збирали за допомогою лазерного сканера (GenePix 4000B, Molecular Device) та оцифровували за допомогою програмного забезпечення для аналізу зображень Array-Pro (Media Cybernetics). Дані аналізували, спочатку віднімаючи фоновий шум, а потім нормалізуючи сигнали за допомогою фільтра LOWESS (локально зважена регресія).

QRT-ПЛР-аналіз

Загальну РНК виділяли та екстрагували із замороженої тканини печінки за допомогою реагенту TRIzol (Invitrogen). КДНК синтезували із застосуванням зворотної транскриптази зі специфічним для miRNA праймером стовбурової петлі (RiboBio, Гуанчжоу, Китай) або праймерами oligo dT (Thermo, Waltham, MA, USA). Інакше PCR-RT проводили на ПЛР-системі ABI 7500 в режимі реального часу (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США), використовуючи маточну суміш SYBR Green (CoWin Biotech, Пекін, Китай). Відносна кількість мікроРНК нормалізувалася до невеликої ядерної РНК U6, а рівні експресії генів нормалізувались щодо ендогенного еталонного гена, гліцеральдегідфосфатдегідрогенази (GAPDH). Відносну кількість кожної мікроРНК та кожного гена вимірювали методом 2 -ΔΔCt. Всі реакції qRT-PCR проводили у трьох примірниках. Праймери, що використовуються для qRT-PCR, наведені в таблиці 1.

Повний розмір таблиці

Ідентифікація потенційних мішеней гена miRNA

Прогнозовані генні мішені для всіх диференційовано експресованих miRNA ідентифікували за допомогою трьох баз даних, а саме TargetScan, PicTar та miRanda 36. Потім усі передбачені цілі, визначені в базі даних, піддавались аналізу генів GO (www.geneontology.org) з метою розкриття мережі регуляторних генів miRNA на основі біологічних процесів та молекулярних функцій 37. Збагачення дозволило виміряти важливість функції. Аналіз шляхів використовувався для визначення значущих шляхів диференціальних генів згідно з KEGG. Точний тест Фішера та тест χ 2 використовувались для класифікації категорії GO та значущого шляху. Швидкість помилкового виявлення (FDR) була розрахована для корекції значення P. З кожної миші отримували р-значення 6 CSH. Методом виключення трипанового синього було визначено, що чистота свіжоізольованих живих ГСК перевищує 95%.

трансфекція miR-146a-5p у HSC

Клітини HSC (LX-2, HSC-T6) висівали при щільності 2х10 5/мл і середовище замінювали свіжим середовищем DMEM без антибіотиків. Мімік 50 нМ miR-146a-5p або інгібітор 100 нМ miR-146a-5p (Ribo Bio, Гуанчжоу, Китай) трансфікували в HSC з використанням ліпофектаміну 2000 (Invitrogen, Карлсбад, Каліфорнія, США). втрата експериментів з функцією miR-146-5p відповідно. Відповідну негативну послідовність (імітаційний контроль або інгібіторний контроль) використовували з тією ж концентрацією, що і контролі в експериментах з miРНК. Через 5 год культивування трансфекційною сумішшю культуральне середовище клітин замінювали 10% FBS/DMEM антибіотиками. Через 48 год після трансфекції клітини збирали обережною трипсинізацією, промивали сольовим розчином, забуференним фосфатом. Всі експерименти повторювали у трьох примірниках.

Втручання та трансфекція РНК

Клітини HSC-T6 трансфікували siRNAs проти Wnt1 або siRNAs проти Wnt5a, а контрольні siRNAs (Ribo Bio, Гуанчжоу, Китай), що складаються із скремблированной послідовності, що не призводить до специфічної деградації клітинного повідомлення. SiRNA трансфікували в клітини HSC-T6 за допомогою ліпофектаміну 2000 (Invitrogen). Ефективність нокдауну оцінювали за допомогою qRT-PCR та вестерн-блот. Синтезовані олігопродукти представлені в таблиці 1

Імуноцитохімічний аналіз

HSC вирощували на предметних предметних стеклах та проводили експерименти трансфекції, як описано раніше. Клітини фіксували у 4% параформальдегіді протягом 15 хв і тричі промивали PBS. Клітини просочували X-Triton 100 протягом 20 хв і тричі промивали PBS. Далі клітини блокували 5% бичачого сироваткового альбуміну в PBS протягом 1 години, потім інкубували з первинними антитілами проти десміну (ProteinTech Group, Чикаго, США) та a-SMA (Novus Biologicals, Littleton, USA) протягом 16 годин при 4 ° C за ніч. Після трьох промивань PBS застосовували вторинне антитіло та інкубували протягом 1 години. Після додаткового промивання клітини аналізували за допомогою флуоресцентної мікроскопії.

Тест на проліферацію клітин

Через п'ять годин після трансфекції за допомогою імітацій мікроконтролерів miR-146a-5p або імітації контрольних клітин LX-2 і HSC-T6 повторно висівали на 96-лункові планшети при щільності 5 × 10 3 клітин на лунку для 1, 2, 3, 4, 5д. Клітини аналізували на проліферацію з використанням набору клітин 8 (CCK-8, Додзіндо, Кумамото, Японія), відповідно до інструкцій виробника. Експерименти проводились тричі самостійно.

Вестерн-блот-аналіз

Загальну кількість білків екстрагували з тканини печінки та клітин за допомогою радіоімунопреципітаційного буфера (RIPA). 80 мкг зразків білка відокремлювали 10 або 12% гелем SDS-PAGE і переносили на мембрани PVDF (Millipore Corporation, Billerica, MA, США) за допомогою електроблотингу. Мембрани блокували на 60 хвилин у буфері, що містив 0,1% Твін-20 та 5% молока. Мембрани інкубували протягом ночі при 4 ° C з первинними антитілами проти SMA, Col-1, MMP-2 (Bioss, Пекін, Китай), Smad7 (Novus Biologicals, Літтлтон, США), Wnt1 (Abcam, Cambridge, MY). США), Wnt5a (Novus Biologicals, Літтлтон, США), β-катенін, GSK-3β (ProteinTech Group, Чикаго, США), NFAT5 (Санта-Крус, Каліфорнія, США). Імунні комплекси виявляли за допомогою вторинних антитіл, кон'югованих з пероксидазою хрону (HRP) (ProteinTech Group, Чикаго, США), а потім візуалізували методом ECL. Β-актин (Бостер, Ухань, Китай) служив контролем завантаження. Інтенсивність кожної цікавої смуги білка визначали за допомогою денситометрії за допомогою програмного забезпечення Quantity One 4.6.3 (Bio Rad).

Аналіз активності люциферази

Послідовність сегментів з насінням дикого типу (WT) або мутантного (Mut) регіону Wnt1 та Wnt5a була синтезована та клонована у вектор люциферази psiCHECKTM -2 (Promega, Madison, WI, USA) між сайтами Xho I та Не я обмеження. Порожній вектор-репортер люциферази використовували як негативний контроль. Клітини HEK-293T вирощували в 24-лунковому планшеті і кожну лунку трансфікували 200 нг відповідних конструкцій psi-CHECK2 3′UTR, і 50 нМ miR-146a-5p імітують або імітують контроль, і 100 нМ інгібітор або інгібітор, використовуючи реагент для трансфекції ліпофектаміну 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), згідно з протоколом виробника. Через 5 годин середовище для трансфекції OptiMEM (Invitrogen, Каліфорнія, США) замінили DMEM. Клітини збирали та аналізували через 48 годин після трансфекції за допомогою системи аналізу люциферази (Promega). Синтезовані олігопродукти представлені в таблиці 1.

статистичний аналіз

Дані виражаються як середнє значення ± стандартне відхилення. Статистичний аналіз проводили за допомогою SPSS 17.0. Для статистичного аналізу використовували односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) та t-критерій Стьюдента. P