Модель гіперандрогенної миші для вивчення протоколу синдрому полікістозних яєчників (переклад на німецьку)
Резюме
Ми описуємо розробку худої моделі миші, подібної до СПКЯ, з використанням дигідротестостерону гранул для вивчення патофізіології СПКЯ та потомства цих PCOS-подібних дамб.
Анотація
Гіперандрогенемія відіграє вирішальну роль у репродуктивній та метаболічній функціях у жінок та є ознакою синдрому полікістозу яєчників. Розробка тонкої моделі миші, подібної до СПКЯ, яка імітує жінок із СПКЯ, є клінічно важливою. У цьому протоколі ми описуємо таку модель. Вставивши довжину кристалів порошкових гранул DHT (дигідротестостерону) 4 мм (загальна довжина гранул 8 мм) і замінюючи її щомісяця, ми можемо використовувати PCOS-подібну модель миші з рівнем DHT у сироватці крові в 2 рази вище, ніж мишам, яким не імплантували Виробляти ДГТ (не ДГТ). Ми спостерігали порушення репродуктивної та метаболічної функцій, не змінюючи ваги або складу тіла. Проявляючи високий рівень безпліддя, невелика частина цих мишей, схожих на СПКЯ, може завагітніти, а їх потомство демонструє затримку статевого дозрівання та підвищений рівень тестостерону у дорослих. Ця тонка модель миші, схожа на СПКЯ, є корисним інструментом для вивчення патофізіології СПКЯ та нащадків цих PCOS-подібних дамб.
Вступ
Ця нова парадигма (відповідні критерії суспільства NIH та AE-PCOS) моделює хворобу, виробляючи відносно подібні рівні андрогенів до рівня жінок із СПКЯ у 2-3 рази вищими рівнями тестостерону або ДГТ порівняно з жінками, які не зазнали впливу. Однак ця модель підтримується постійним екзогенним ДГТ, а не програмованою ендогенною гіперандрогенією після відміни ДГТ. Загальна мета цієї статті - зосередитись на 1) способі гранулювання ДГТ; (2) як генерувати Lean PCOS, як модель миші; (3) Стратегії оцінки жіночого потомства з цих дамб. Інші вимірювання та оцінка фенотипів у цьому рукописі не висвітлюються, але їх можна знайти в 5, 15, 23, 24, 25, 26.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Тут ми представляємо докладні протоколи для приготування та включення гранул DHT "та" для репродуктивного та метаболічного тестування. Миші, що використовувались у цьому дослідженні, були змішаного походження (C57/B6, CD1, 129Sv) і про них доглядали з їжею та водою ad libitum у циклі 14/10 год світло-темно при 24 ° C на Бродвеї Будівля дослідницьких приміщень у Медичній школі університету Джона Гопкінса. Усі процедури були затверджені Комітетом з догляду та використання тварин Університету Джона Хопкінса.
1. Створіть PCOS-подібну модель миші
2. Оцініть репродуктивні профілі жіночих нащадків від хронічно закріплених DHT дамб
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Рівень ДГТ у сироватці крові та тест на толерантність до глюкози
Рівні DHT вимірювали із зібраної сироватки як ELISA, так і LC-MS, використовуючи протоколи 1.24-1.25 та 2.9, 3.0. Абсолютні значення DHT відрізняються між мас-спектрометрією та ELISA, однак відносна складність DHT проти вставки без DHT є подібною як в аналізах, так і в експериментах 15, 23, 24 ((приблизно 2-кратна) Рисунок 2A). Рівні DHT значно підвищуються у мишей DHT та no-DHT через упередження через вагітність, але рівні DHT у 2 рази вищі у мишей DHT порівняно з мишами без DHT в обох прегестаційних (за день до спарювання) ) та гестаційний вік (приблизно 14 днів) у рази (рис. 2 b). Оскільки ELISA та LC-MS диференціюють абсолютні рівні ДГТ, ми обчислюємо відносні рівні (зміна в кратному рівні: рівень ДГТ із введенням ДГТ проти введення без ДГТ) в рамках аналізів. Жінки-миші з ДГТ показали порушення толерантності до глюкози порівняно з відсутністю ДГТ через 2 тижні після введення ДГТ згідно з протоколом 1.23 (рис.3)).
Вага тіла та статеве дозрівання жіночого потомства
Хоча в основному стерильні, деякі дами вагітні і мають цуценят (близько 30% випадків вагітності, тому ми отримуємо плоди плодючості за 10 тестів, як правило, 3 вагітних дам, див. Протокол 2.1). Тому ми можемо оцінити хронічний вплив андрогенів на дамби на жіноче потомство. Жінки-нащадки дамб, що вставляють DHT, називаються дочками DHT, а жінок, які не мають вставлених DHT дамб, - дочками, які не мають DHT. Ми не спостерігали різниці між дочками, які не мають ДГТ та ДГТ, за віком вагінального отвору. Однак перший еструс для дочок ДГТ значно затримується (день 35 для дочки без ДГТ; день 42 для дочки ДГТ). Це пов’язано зі зниженням маси тіла у дочок, що страждають від ДГТ, у 35 та 42 ПНД у порівнянні з дочками, які не мають ДГТ (Рисунок 4; посилання на протокол 2.4 - 2.7).
Рівень гормону та естральна циклічність у жіночих нащадків
Рівні тестостерону не змінюються при 21 PND, але знижуються при 26 PND. Однак рівень тестостерону підвищується на рівні 70 фунтів стерлінгів (рисунок 5, посилання на Протокол 2.9-3.0). Дорослі дочки ДГТ демонстрували порушену естральну циклічність у порівнянні з дорослими дочками без ДГТ, значно довші в м/добу та менше часу в Р та Е (рис. 6А, B.; згідно методу в протоколі 1.17 - 1.22).
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Гіперандрогенія є ключовою характеристикою СПКЯ. Рівні DHT у сироватці крові (у два рази вищі у мишей DHT, ніж у мишей без DHT), використовувані в цьому протоколі, нижчі, ніж рівні, про які повідомляли інші дослідники в попередніх дослідженнях, і відкалібровані, щоб пропорційно імітувати жінок із СПКЯ 5, 19, 20, 21. На відміну від інших моделей, ця 2-кратна модель ДГТ не змінює ваги тіла та складу всього тіла порівняно з мишами без ДГТ до 3,5 місяців після введення ДГТ 23, 24. Ці дорослі миші, імплантовані в ДГТ, підтримуються постійним екзогенним ДГТ. Незважаючи на те, що склад всього тіла не змінюється, у худих жінок СПКЯ спостерігається зміна структури та функції адипоцитів 20. Гарантоване ретельне вивчення різних складів. Ми спостерігали погіршення естральної циклічності протягом одного тижня після введення ДГТ 15 та зниження народжуваності протягом тримісячного рейтингу народжуваності 23.
Невелика підгрупа DHT-мишей, які лікували самок, які могли зачати і мати потомство, дала можливість оцінити вплив передгестаційної, гестаційної та годувальної гіперандрогенемії на розвиток плода. Для отримання належним чином контрольованого експерименту необхідні кілька племінних сук, що вимагає встановлення щонайменше 10 парних пар. Дочки ДГТ піддаються дії ДГТ лише під час вагітності та до 21 ПНК. Дочки ДГТ демонстрували меншу масу тіла порівняно з дочками, які не отримували ДГТ, що вказує на те, що ожиріння або надмірна вага не є незрозумілими змінними у спостережуваних фізіологічних ефектах 15 .
У початкових дослідженнях ми перевіряли рівень ДГТ у сироватці крові з часом. Ми не виявили суттєвих відмінностей у вмісті ДГТ у сироватці крові на 1, 2, 3 та 4 тижнях 23, 24. Рівень DHT знижувався через 4 тижні, тому ми замінюємо гранули DHT кожні 4 тижні. Ми не спостерігали зниженого впливу ДГТ, який також зберігали протягом 3 місяців при кімнатній температурі. Важливо інкубувати гранули в сольовому розчині протягом 24 годин перед введенням. Цей етап важливий для рівномірного вивільнення ДГТ із гранул (ДГТ повільно випускається через силастичні трубки). Еструсну циклічність можна перевірити через 3 дні введення ДГТ, а вагінальний мазок також можна досліджувати безпосередньо у фізіологічному розчині без хімічних речовин та плям під світловим мікроскопом після ознайомлення з клітиною 27 типів.
Метаболічний фенотип можна оцінити через 2 тижні (14 днів) введення ДГТ. Однак вплив ДГТ на метаболізм наприкінці четвертого тижня (28 днів) дещо послаблюється, хоча ніякого ослаблення репродуктивної дисфункції не спостерігається. Тому ми зазвичай оцінюємо метаболічну функцію наприкінці 2, 3, 5, 6, 7 тижнів (вставляємо 14, разом 21, 35, 42 та 49 днів 2 рази). Лабораторне виготовлення стероїдних гранул із повільним вивільненням - це зріла техніка, яка широко застосовується в різних лабораторіях 33,34. Це являє собою недорогу альтернативу комерційним продуктам, вартість яких перевищує 50 доларів США/гранула (гранули ДГТ 90 днів, ніж 5 мг/гранула, IRA, NA-161). Комерційний продукт має ту перевагу, що не потребує заміни до 90 днів, тоді як пелети, описані в цьому звіті, повинні бути замінені кожні 28 днів. Для широкомасштабних досліджень слідчим може бути вигідніше виробляти власні гранули навіть при додатковій роботі, необхідній для заміни гранул кожні 4 тижні.
Як спостерігали інші, моделі з хронічною імплантацією ДГТ після пологів не показують підвищеної частоти пульсацій ЛГ, і це може свідчити про різні патологічні механізми посиленої андрогенно-репродуктивної функції між розвитком та пізно набутою гіперандрогенією. За допомогою цього протоколу ми можемо дослідити нащадків жінок від хронічно гіперандрогенних дамб. Ми можемо використовувати цю модель, щоб спробувати зрозуміти репродуктивні (наприклад, розвиток фолікулів, овуляцію (Corpora Lutea) і фертильність) та метаболічні наслідки (наприклад, метаболізм глюкози або ліпідів, склад тіла, жирове депо. (Розподіл). Наш протокол додає новий інструмент для дослідження підвищених репродуктивних та метаболічних порушень, спричинених андрогенами, та віддаляє патофізіологію, спричинену підвищеним андрогеном, від тих, які можуть бути обумовлені ожирінням. Ця модель може бути використана для вивчення специфічних для тканин ефектів підвищених андрогенів у жінок Крім того, методологія, викладена тут для виробництва гранул ДГТ, може бути легко застосована для вивчення інших стероїдних гормонів.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.