Напівпродуктивний метод візуалізації та набір інструментів візуалізації даних для аналізу C.

Резюме

Ця робота описує протокол напіввисокої пропускної здатності, який дозволяє одночасно проводити тривимірну візуалізацію ембріогенезу в 80–100 С. ембріонів за один нічний пробіг. Інструменти обробки та візуалізації зображень також включені для оптимізації аналізу даних. Поєднання цих методів із індивідуальними штамами-репортерами дозволяє детально контролювати ембріогенез.

Анотація

Вступ

Ембріон C. elegans є важливою модельною системою для механістичної біології клітини та аналізу специфікації клітинної долі та морфогенетичних подій, що обумовлюють розвиток ембріона 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9. На сьогоднішній день значна частина характеристик як подій на клітинному рівні, так і специфікацій долі клітини в ембріоні була досягнута за допомогою експериментів з відносно високою тимчасовою роздільною здатністю з використанням флуоресцентних маркерів. Хоча цей підхід добре працює для подій порядку секунд до десяти хвилин, він стає технічно обмеженим для характеристики довших процесів в порядку від годин до днів. Ембріональний розвиток від першого розщеплення до кінця розтягування займає близько 10 годин. У цей часовий проміжок часу методи напівпропускної здатності, які дозволяли б одночасно проводити візуалізацію з меншим часовим дозволом (тобто отримання через інтервали часу 5-20 хв) більших когорт ембріонів з різних умов, відкрили б новий набір експериментів; z. В. забезпечення можливості систематичних широкомасштабних скринінгових зусиль та аналізу достатньої кількості ембріонів для порівняння наслідків молекулярних розладів.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Протокол

1. Підготуйте ембріони C. elegans до високопродуктивної візуалізації

ПРИМІТКА: Метою цієї частини протоколу є створення популяції напівсинхронізованих (від 2 до 8 клітинної стадії) ембріонів C. elegans, які розсікаються відповідними штамами-маркерами (Рисунок 2) у скляну нижню 384-лункову пластину для візуалізації. Інші формати пластин також можуть працювати, але переважно платівки з 384 лунок, оскільки невеликий розмір лунки обмежує розповсюдження ембріонів на відносно невеликій площі, що полегшує ідентифікацію полів, що містять кілька ембріонів, для тимчасового знімка. Приблизна синхронізація ембріонів забезпечує запис всього процесу розвитку кожного з ембріонів у полі.

2. Оцінка ембріональної летальності

Скановані поля використовуються для оцінки летальності ембріонів та дефектів личинок шляхом підрахунку вилупилися червів та невилуплених ембріонів для кожної лунки.
Досягнення невилуплених ембріонів як ембріональної летальності. Виключіть заарештовані одно-чотириклітинні ембріони з оцінки летальності, оскільки молоді розсічені ембріони іноді не можуть завершити формування яєчної шкаралупи (якщо мейоз II ще не завершений), а дефекти проникності можуть призвести до осмотичних ускладнень протягом перших двох років. Сфери бізнесу.
Оцініть частково вилуплених або повністю вилуплених хробаків з морфологією тіла або порушеннями поведінки, такими як глухий або паралізований, як "ненормальну личинку".

3. Автоматизоване обрізання (рис. 3А.)

ПРИМІТКА: Програмне забезпечення розміщується у двох місцях: (1) Зенодо містить зручну для користувача версію програмного забезпечення 12, яка не потребує знань з програмування. (2) Github містить вихідний код нашого програмного забезпечення embryoCropUI.py та screenCrop.py 13, які вимагають знання Python. Детальні вказівки щодо завантаження та експлуатації обох версій програми наведені нижче.

4. Візуалізація (рис. 4)

ПРИМІТКА: OpenandCombine_embsV2.ijm 10, 12 - це макрос ImageJ, який створює легко впізнаваний файл tiff з усіх зображень для певного розтягування та стану. Потрібна установка FIJI/ImageJ 14, 15. Цей макрос виконується відповідно до нашої файлової структури. Його потрібно змінити для роботи з різними структурами файлів. Інструкції щодо правильної структури файлу та детальний опис важливих міркувань можна знайти в кінці Файл GUI_Instructions_zenodo_repoV2.docx у сховищі Zenodo. Будь ласка, прочитайте ці інструкції повністю, перш ніж переглядати зображення імен та структурування файлів правильно, щоб отримати найкращий інтерфейс з цим макросом. Для довідки наша структура розташування файлів виглядає так:
Z: -налаштований, Target'Strain'Emb'Target_Emb'_15 Унікальний ідентифікатор цифр _W '# F_T' #_ Z '#_ C'.tif
наприклад Z: -cropped-EMBD0001-GLS-Emb1-EMBD0001_Emb1_20140327T135219_W02F1_T01_Z01_C1.tif

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Основною проблемою, що характеризує вплив молекулярних порушень на ембріональний розвиток C. elegans, є те, що для прогресування ембріонів від першого розщеплення до кінця розтягування при 20 ° 16 потрібно приблизно 10 годин. Підхід з напівпропускною здатністю, який дозволяє одночасно зображувати великі когорти ембріонів, корисний для подій у цьому часовому масштабі, оскільки дозволяє паралельно відображати кілька умов із достатнім розміром ансамблю для кожної умови, щоб дозволити кількісний аналіз (Рисунок 1А.).

Рисунок 2. Спеціальні штами, створені для візуалізації ембріогенезу C. elegans з високою роздільною здатністюбули. (А.) Схеми ілюструють трансгени, що використовуються для побудови штамів зародкового шару (зверху) та морфогенезу (знизу). (B.) Проекційні поверхні з максимальною інтенсивністю показують хід розвитку в морфогенезі штамів (вгорі) та зародковому шарі (внизу). Вентральний вигляд показаний, як показано на електричних схемах (зліва). Час відносно десяткової коми (t = 0), яку легко ідентифікувати в обох стеблах. Шкала шкали = 10 м. Фігура з дозволу Wang et al. 10 відтворено. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Рисунок 3. Спеціальна програма обрізання ізолює та орієнтує окремі ембріони з полів візуалізації. (А.) Схема ілюструє функціональність користувальницької програми обрізання ембріонів та висвітлює два варіанти доступу до цієї програми: зручний інтерфейс графічного інтерфейсу, який не вимагає знань програмування і базується на Zenodo (ліворуч) та пакетну версію програми обрізання, Python Потрібен досвід і доступний на Github (праворуч). (B.) Графіка узагальнює алгоритм автоматизованого обрізання - бінарна маска генерується з 8-бітних зображень яскравих полів, а окремі ембріони розпізнаються, вирізаються та вирівнюються вздовж передньої задньої осі. Шкала шкали дорівнює 10 м. (C.) Схематично описують процес, що використовується для ітераційного розпізнавання ембріонів у бінарній масці. (Д.) Схематично ілюструє метод орієнтування ембріонів уздовж передньо-задньої осі. Панелі B-D відтворені з дозволу Wang et al. 10. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього зображення.

Рисунок 4. Спеціальний макрос ImageJ дозволяє візуалізувати дані скринінгу RNAi, створюючи складені файли для кожної умови. (А.) Показані ембріони для трьох прикладів умов RNAi із набору тестів гена 40 (див. Повний набір даних Wang et al. 10, 11) (праворуч), виділяючи різні фенотипи сигнатур, які є загальними для кожного, і відтворюваність фенотипи в межах кожного стану. Панель була виготовлена з дозволу Wang et al. 10 адаптований. (B.) Панель управління ілюструє, як користувальницький макрос ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm) створює ембріони із конкретного стану RNAi у складений файл ImageJ, який встановлює яскраве поле та прогнози максимальної інтенсивності для кожного ембріона в кожен момент часу. Хоча виділено лише один приклад, цей макрос може компілювати дані для багатьох умов RNAi одночасно. Макрос ImageJ доступний на Zenodo 12. Шкала масштабу = 10 м. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цієї ілюстрації.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Разом метод напіввисокої пропускної здатності разом із описаними тут інструментами для обрізання ембріонів та обробки зображень полегшить аналіз ембріонального розвитку C. elegans з різними мутантами, розладами та штамами-маркерами. В даний час у нашій власній лабораторії проводиться широкомасштабний екран з використанням цих методів для зйомки ембріонів із двох описаних тут штамів після того, як для розвитку знадобилося 2000 генів. Зрештою, дані цих зусиль слугуватимуть ще одним ресурсом для посилення зусиль, щоб зрозуміти специфікацію долі клітини та морфогенетичних подій під час ембріогенезу.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.