Нуклеосоми як параметри клітинної смерті у хворих на злоякісні пухлини - PDF скачати безкоштовно

Від Інституту клінічної хімії при виконавчому комітеті університету імені Людвіга-Максиміліана-Мюнхена: проф. Лікар. hc.c. Нуклеосоми Д.Зайделя як параметри клітинної смерті у хворих на злоякісні пухлини Дисертація на здобуття докторської ступеня в галузі медицини на медичному факультеті Університету Людвіга Максиміліана в Мюнхені, представлена Стефаном Холденрідером з Єттінгена-Шеппаха 24

II З дозволу медичного факультету Мюнхенського університету 1. Доповідач: проф. Лікар. hc.c. Д.Зайдель 2-й доповідач: проф. C. Нерль Співдоповідач: Priv. Доз. Р. Холле проф. Д-р Дж. П. Джонсон Співпраця працівника доктора філософії: д-р Петра Штібер Декан: проф. Лікар. hc.c. К. Петра День усного іспиту: 15.1.24

III Присвячується моїм батькам

IV Попередні публікації: Заявка на патент: Roche Diagnostics, Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Schalhorn A Продовження терапії у пацієнтів, у яких апоптоз викликаний в результаті захворювання або терапії, шляхом виявлення апоптозу продуктів. Номер патенту: 4918/OA/WO - Ts Оригінальні статті: Holdenrieder S, Stieber P, Förg T, Kühl M, Schulz L, Busch M, Schalhorn A, Seidel D Апоптоз в сироватці крові пацієнтів із солідними пухлинами Anticancer Res. 19: 2721-2724 (1999) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Ready G, Fürst H, Schmeller N, Untch M, Seidel D Нуклеосоми в сироватці крові як маркер для загибелі клітин Clin Chem Lab Med 39: 596-65 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D Нуклеосоми в сироватці пацієнтів з доброякісними та злоякісними захворюваннями Int J Cancer (Pred Oncol) 95: 114-12 (21 ) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, v Pawel J, Schalhorn A, Nagel D, Seidel D Циркулюючі нуклеосоми в сироватці Ann NY Acad Sci 945: 93-12 (21) Holdenrieder S, Stieber P, Bodenmüller H, Busch M, Ready G, Fürst H, Schalhorn A, Schmeller N, Untch M, Seidel D Кількісне визначення нуклеосом у сироватці крові методом ELISA для виявлення клітинної смерті плюс Biochemica 1 (22): 25-27

VI ЗМІСТ 1 ВСТУП І ЗАПИТАННЯ I 2 ІНФОРМАЦІЯ 4 2.1 СМЕРТЬ КЛІТИН 2.1 2.1.1 ІСТОРІЯ ДОСЛІДЖЕННЯ КЛІТИННОЇ СМЕРТІ 4 2.1.2 МОДЕЛЬ ДИХОТОМІЧНОЇ СМЕРТІ КЛІТИНИ 2.1 2.1.3 МОДЕЛЬ ІНТЕГРОВАНОЇ КЛІТИНИ СМЕРТІ 17 2.1.4 СМЕРТЬ КЛІТИН У ФІЗІОЛОГІЧНОМУ ПРОЦЕСІ 21 2.1.5 6 ГЕНЕТИЧНЕ РЕГУЛЮВАННЯ АПОПТОТИЧНОЇ КЛІТИННОЇ СМЕРТІ 28 2.1.7 СИГНАЛЬНІ ШЛЯХИ АПОПТОТИЧНОЇ КЛІТИННОЇ СМЕРТІ 31 2.1.8 ІНДУКТОРИ АПОПТОТИЧНОЇ КЛІТИННОЇ СМЕРТІ 4 2.1.9 СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ СМЕРТІ КЛІТИНИ 43 2.2 НУКЛЕОЗОМИ 57 2.2.1 СТРУКТУРА І ФУНКЦІЯ ЦУКИ 2.2.3 КОЛОКУЛЮВАННЯ ЯДЕРНИХ КИСЛОТ В ПЛАЗМІ ТА СИРОТКІ 68 3 МЕТОДОЛОГІЧНИЙ ТЕХНОЛОГІЯ НУКЛЕОЗОМЕНТНОГО ТЕСТУ 8 3.1 ІМУНХІМІЧНІ МЕТОДИ ВИЗНАЧЕННЯ І ВИМІРЮВАННЯ 8 3.2 МЕТОДИЧНІ ОСНОВИ ПОЧАТКОВОГО ТЕСТУ 82 3.3 МОДИФІКАЦІЇ ТА СТАНДАРТИЗАЦІЯ 3.4 ПАЦІЄНТИ 92 4.1.1 ЗДОРОВІ ОСОБИ 92 4.1.2 ПАЦІЄНТИ З БОЛЕЗНЯМИ ХВОРОБИ 92 4.1.3 ПАЦІЄНТИ З МАЛІГНІЧНИМИ ЗАХВОРЮВАННЯМИ 94 4.2 СТАТИСТИЧНІ МЕТОДИ 97 4.2.1 ОЦІНКА КЛІНІКО-ДІАГНОСТИЧНОЇ ЯКОСТІ 97 4.2.2 СТАТИСТИЧНІ ПРОЦЕДУРИ В ПОПЕРЕКРЕСНИХ ОГЛЯДАХ 12 4.2.3 СТАТИСТИЧНІ ПРОЦЕДУРИ 13

3 1. Чи відрізняються концентрації спонтанних нуклеосом у здорових людей, хворих на доброякісні захворювання та хворих на злоякісні пухлини? Чи можна діагностувати злоякісні захворювання? 2. Чи відрізняються концентрації спонтанних нуклеосом у різних типів пухлин? 3. Чи відрізняються спонтанні концентрації нуклеосом з точки зору таких характеристик пухлини, як стадія, ступінь чи гістологія? 4. Які зміни концентрації нуклеосом виникають внаслідок операцій, інфекцій та послідовного антибіозу, а також під час хіміотерапії та радіотерапевтичного лікування? 5. Чи співвідносяться у людей із злоякісними захворюваннями зміни хімічної та променевої терапії концентрації нуклеосом із клінічною реакцією на терапію та результатами візуалізації? Чи можна проводити терапевтичний контроль за допомогою нуклеосом? Наскільки безпечно і наскільки рано можна оцінити ефективність терапії? 6. Чи співвідносяться концентрації нуклеосом під час хіміотерапії та променевої терапії з іншими онкологічними біомаркерами, що використовуються для контролю ефективності терапії? Чи можлива порівнянна або більш достовірна оцінка терапевтичного успіху за допомогою нуклеосом?

6 На початку 1960-х Р. Локшин та С. Вільямс використовували модель комах для вивчення процесів під час загибелі клітин і ввели термін "запрограмована смерть клітин" як просторово та часово передбачуваний процес (Lockshin 1964). Трохи пізніше Тата і знову Локшин показали, що для загибелі цієї клітини необхідний синтез макромолекул. Вони змогли ефективно запобігти цьому за допомогою інгібіторів РНК та білків (Tata 1966; Lockshin 1969). Нарешті, в 1971 р. Джон Ф. Керр описав так званий усадочний некроз - послідовність змін, які він спостерігав в окремих відмираючих клітинах печінки, які згодом атрофувались після оклюзії ворітної вени щурів (Kerr 1971). Джон Ф. Керр, Ендрю Віллі, сер Аластер Керрі. Через рік разом з Ендрю Віллі та сером Аластером Каррі він ввів термін апоптоз - термін, взятий з грецької мови, що позначає опадання листя восени, і проголосив нову еру сучасності Дослідження загибелі клітин (Керр 1972). Рисунки 2-4 (Каммінгс 1997): Перша особа, яка описала апоптоз Рисунки 5 і 6 (Керр 1994): Апоптотичні клітини з типовими морфологічними характеристиками

9 Рисунок 8: Хронологія дослідження клітинної загибелі

1 2.1.2 Дихотомічна модель загибелі клітин З історичних причин, після того, як Керр ввів термін апоптоз, спочатку було розмежовано типи клітинної смерті, які є результатом зовнішніх та внутрішніх подразників. Клітинні суїциди були розділені принаймні на три типи: ішемічна загибель клітин, смерть вільнорадикальних клітин та генетично регульований апоптоз (Majno 1995). Як запропонував Грепер, останній утворив аналог мітозу. Спочатку під некрозом макроскопічно розуміли залишки мертвих тканин. На клітинному рівні некроз описували як пасивну загибель клітин, спричинену зовнішніми подразниками, на відміну від внутрішньої, активно здійснює деградацію клітин, тобто апоптоз. Ці дві форми застосовувались дихотомічно до всіх явищ загибелі клітин; інші форми загибелі клітин були в основному ігноровані (Wyllie 198a; Kerr 1994). Рисунок 9: Класична модель загибелі клітин (модифікована від Majno 1995): конденсація розриву хроматину ядра клітини непорушена апоптоз плазматичної мембрани дегідратація та усадка клітин апоптотичних тіл набряк клітини та мітохондрії розрив некрозу плазматичної мембрани

21 2.1.5 Клітинна смерть при патологічних процесах Клітинна смерть та проліферація клітин знаходяться в точному регульованому балансі в організмі, а також в окремих органах та функціональних системах. Якщо цей баланс порушується, хвороби можуть розвиватися на всіх рівнях: Гомеостаз Проліферація клітинної смерті Перевага швидкості проліферації над клітинною смертю може призвести до місцевих та системних злоякісних захворювань, а також до метаболічних, запальних та деяких аутоімунних захворювань. Гіперпроліферативні захворювання Проліферація клітинної смерті Надмірна клітинна смерть, навпаки, є основою для розвитку великої кількості дегенеративних, гематологічних, аутоімунних, пов’язаних з ішемією, опосередкованих токсинами та запальних захворювань. Дегенеративні та деструктивні захворювання Проліферація Клітинна смерть Огляд важливості клітинної загибелі при різних захворюваннях наведено в наступній таблиці (Thompson 1995; Fadeel 1999; Robertson 22):

36 Регулювання сигнальних шляхів Для ініціювання та реалізації опосередкованого рецептором апоптозу було визначено деякі центральні шляхи передачі сигналу, які є загальними для всіх клітин, і описано деякі варіативні ділянки, різні в залежності від типу клітини та збудника. Загальні фактори включають утворення DISC із тримеризованих рецепторів, FADD та ініціатора прокаспази 8, а також кінцевого сегмента ефекторних каспаз, зокрема каспази 3, що призводить до активації клітинної структури та ядерних розщеплюючих протеаз. Між ними є три варіативні ділянки: 1. безпосередня активація каскадного каскаду 2. участь мітохондрій з вивільненням цитохрому С 3. активація мітохондрій та вивільнення AIF відповідно до шляху, який ви можете пройти для здійснення апоптозу можна виділити два типи комірок (Scaffidi 1998; Krammer 2a, b): CD95-L CD95-R Рисунок 18: Апоптотичні сигнальні шляхи в клітинах типу I та II (модифіковано з Krammer 2a) FADD/MORT1 DD DD DD DD DD DD FADD Pro - CASP-8 DISC c-flip BID Bcl-2 Bcl-x L CASP-8 Cyto c - Apaf-1 CASP-3 CASP-9 CASP-8 AIF Субстрати смерті ТИП I Апоптоз ТИП II

39 Численні інгібітори ефекторних каспаз об’єднуються у групи ІАП (інгібітори апоптозу). До клітин людини вони включають XIAP (MIHA), c-iap-1 (MIHB), c-iap-2 (MIHC), NAIP та сурвівін. Вони починаються з активованих каспаз 3 і 7 та з апоптосоми і суттєво відрізняються за своєю інгібуючою силою. (Cecconi 1999; Budjhardjo 1999, Thornberry 1998; Jäättelä 1999; Deveraux 1999; Goyal 21). Їх важливість полягає, мабуть, у тонній регуляції сигналу апоптозу. Це також підтверджується вивільненням додаткових IAP-регулюючих білків, таких як Smac (другий активатор каспаз, що походить від мітохондрій) та DIABLO (прямий IAP-зв’язуючий білок з низьким рівнем пі) (Hengartner 2) під час апоптозу. Найважливіші компоненти сигнальних шляхів апоптозу, включаючи гальмівні вихідні точки, проілюстровані нижче: FADD/MORT1 DD DD DD DD DD CD95-L CD95-R FADD/MORT1 Пошкодження ДНК p53 Рисунок 19: Огляд регуляції сигнальних шляхів при апоптозі (змінений згідно з Hengartner 2 та Rosell 22) Pro- CASP-8 DISC BID Bcl-x L Bax Bcl-2 c-flip Bcl-2 Bcl-x L CrmA CASP-8 цитохром c Pro-CASP-9 Bcl-x L Pro-CASP -3 APAF-1 апоптосома CASP-3 IAPs Smac/DIABLO AIF субстрати смерті апоптоз

62 Спіральне скручування супергеліку ДНК всередині нуклеосоми, яке після розслаблення контактів гістон-ДНК розкручується та зміщує гістоновий комплекс (Widom 1997; Kornberg 1999). Для функціонування деяких з цих комплексів, наприклад для фактору ремоделювання нуклеосом NURF, необхідна участь ацетильованих кінців гістону. Огляд комплексів ремоделювання хроматину наведено в наступній таблиці (Kornberg 1999): Промотор P mrna k 12 P нуклеосома k 21 P Скручування ДНК та оголення прогресії ДНК транскрипції P повна транскрипція Рисунок 26: Ремоделювання хроматину за допомогою комплексів ISWI (Widom 1997) Таблиця 8: Групування та характеристики комплексів ремоделювання хроматину Комплекс ремоделювання хроматину Організм АТФаза Молекулярна маса (MDa) Субодиниці SWI/SNF сімейства SWI/SNF S. cerevisiae SWI2/SNF2 2 11 RSC S. cerevisiae STH1 1 15 Brahma D. melanogaster Brahma 2 ND H SWI/SNF H.sapiens hbrm 2 1 H SWI/SNF H.sapiens BRG1 2 1 NRD H.sapiens CHD4 1,5 18 ISWI family I SWI1 S.cerevisiae ISWI1,4 4 I SWI2 S.cerevisiae ISWI2,3 2 NURF D.melanogaster ISWI, 5 4 CHRAC D.melanogaster ISWI, 7 5 ACF D.melanogaster ISWI, 2 4 RSF H.sapiens hiswi, 5 2