PDF 3 Матеріали та методи - Безкоштовно завантажте PDF
Короткий опис
1 3 Матеріал та методи 3.1 Експериментальна установка, матеріал тварин, утримання та годівля У два експериментальних прогони .
Опис
Експериментальна установка, матеріал тварин, утримання та годівля
Вплив в'язкості травлення на морфологію та гістологію тонкої кишки свиней досліджували у дві проби. Для цього було сформовано контрольну групу та випробувальну групу, кожна із шести свиней. Під час першого пробного циклу годували напівсинтетичний раціон на основі кукурудзяного крохмалю та ізоляту соєвого білка (дієта С). Для збільшення в'язкості травлення 2% кристалічної целюлози замінили високов'язким модельним субстратом карбоксиметилцелюлозою (дієта CMC). Під час другого пробного циклу годували дієту, яка складалася переважно з жита та пшениці і, таким чином, містила природні фактори, що підвищують в’язкість (дієта К). В'язкість дигестиру досліджуваної групи (дієта Е) знижували додаванням ферментного препарату, що містить ксиланазу (Zy 68; 480 МО/кг корму). У таблиці 1 наведено склади різних дієт; У таблиці 2 наведено вміст поживних речовин та відповідні в’язкості екстракту.
Таблиця 1: Склад напівсинтетичних дієт C і CMC, а також дієт K і E на основі зерна.
Компоненти [г/кг uS] кукурудзяний крохмаль жито пшениця соєвий білок ізолят целюлоза, кристалічний1 карбоксиметилцелюлоза 2 глюкоза соєва олія монокальцій фосфат кормове вапно, газований премікс3 калій гідрокарбонат магній оксид лізин метіонін треонін триптофан Zy 684
680 134 50 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -
680 134 30 20 50 20 30 10 15 7,5 1 0,4 1,4 0,8 -
658 200 73 20 19 13 12 2,6 1,1 1,1 0,2 -
658 200 73 20 19 13 12 2,6 1,1 1,1 0,2 0,4
1Viva Pur ® тип 200; Целюлозні комбінати Rettmaier & Sons, Ellwangen-Holzmühlen 2Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Німеччина 3Lohmann Animal Health & Co.KG, Куксхафен; Вміст на кг: 1,2 млн. МО Віт А; 120 000 МО Vit D3; 4 г Віт Е; 200 мг Віт В1; 600 мг Віт В2; 2500 мг ніацину; 400 мг Віт В6; 4,5 мг Віт В12; 20 мг біотину; 1800 мг пантотенової кислоти; 160 грамів натрію; 50 грамів магнію; 10 грамів цинку; 7,5 г заліза; 7,5 г марганцю; 150 мг йоду; 70 мг кобальту; 40 мг селену 4Lohmann Animal Health & Co. KG, Куксхафен; Zy 68 містить 1192 МО активності ксиланази на g
Матеріал та методи Таблиця 2: Проаналізовано та розраховано вміст поживних речовин у напівсинтетичних дієтах C та CMC, а також на зернових дієтах K та E.
Суха речовина Сирий білок Сирий жир Зола Сира клітковина NfE NDF ADF Загальний NSP1 (розчинний)
900,7 115,0 19,9 44,6 (50) 4 671,2 * * *
896,6 116,2 25,3 32,8 (30) 4692,3 * * *
Арабіноза (розчинна) Ксилоза (розчинна) Манноза (розчинна) Глюкоза (розчинна) Галактоза (розчинна) Конвертована енергія [МДж/кг мкг] 2 Здається, точно засвоюваний сирий протеїн3 В’язкість екстракту [мПас]
901,9 131,9 32,9 51,3 17,0 668,6 145,9 27,4 103,4 (24,8) 19,4 (4,7) 50,2 (11,8) 4,0 (1,5) 26,0 (5,7) 3,8 (1,1) 13,4
898,9 131,9 31,4 49,7 17,3 668,6 134,6 28,0 102,6 (30,5) 19,1 (4,9) 49,4 (13,0) 2,7 (0,8) 27,8 (9,8) 3,6 (2,0) 13,4
1 визначають, як описано у Bartelt et al. (2002) 2 розраховано відповідно до вмісту енергії в окремих компонентах (DLG, 1991) 3 розраховано відповідно до інформації про вміст та засвоюваність сирого білка в ізоляті жита, пшениці та соєвого білка у CVB (1996) та Grala et al. (1998) 4 не відповідає вмісту в раціоні кристалічної целюлози *
24 дослідних тварини були свинями за програмою Шаумана. У цій програмі розведення кроси порід дойче ландрас і дюрок використовуються в якості материнської лінії, а поперечні продукти рас ландрас В і Хемпшир як батьківська лінія. Всі поросята отримували ін’єкцію заліза-декстрану у віці трьох днів; самці були кастровані на 15-й день життя. Шість поросят було вибрано навмання з двох одночасних послідів, незалежно від статі, і відлучені від грудей на 28-й день життя. Шість односмітників були рівномірно розподілені між контрольною та досліджуваною групою (C або CMC або K або E). Період годування тривав три тижні в обох тестових пробігах. Свиней розміщувались в окремих боксах площею підлоги 1,20 х 1,60 м із повністю решітчастою підлогою. Між сусідніми коробами був візуальний контакт. Свині з різних груп не мали безпосереднього контакту. 29
Годування проводилося щодня о 8:00 та 16:00, борошноподібний корм змішували з триразовою кількістю води. Кількість раціону була адаптована до споживання корму ad libitum таким чином, щоб вона становила 100 г в перший день і в середньому 1100 г в останній день експерименту. Перед післяобіднім годуванням ящики щодня очищали водою. За цей час три ящики кожної групи кормів були з’єднані між собою. Загальний стан свиней перевіряли щодня. Протягом трьох тижнів експерименту свині мали в своєму розпорядженні різні іграшки, такі як кулі, закруглені металеві прутки або пластикові диски. Тварин зважували як на початку експерименту, на 28-му дні життя, так і за день до кінця експерименту.
потім відкривали поздовжньо і, нарешті, тричі промивали в теплому фізіологічному розчині хлориду натрію. Кишкові частини розкладали на паперових рушниках для вимірювання довжини і залишали там сушитися приблизно на п’ять хвилин. Потім окремі секції зважували. Всі окремі кроки виконувала одна і та ж людина. Протягом усієї процедури звертали увагу на особливості та макроскопічно впізнавані патологічні процеси. Вагу та довжину окремих відділів кишечника щодо маси тіла розраховували пізніше за параметрами ваги та довжини окремих відділів кишечника. Крім того, коефіцієнт довжини та ваги реєстрували як міру товщини стінок тонкої та товстої кишок.
Вимірювання в'язкості дайджеста
Вилучену дигесту охолоджували на льоду відразу після її отримання, поки зразки не центрифугували при 13000 об/хв (відносне відцентрове прискорення 13600 г) протягом 10 хвилин (центрифуга типу 5415 C з Еппендорфа, Німеччина). В'язкість 0,5 мл супернатанту визначали за допомогою віскозиметра (тип LVDV II; конусний шпиндель вимірювальної головки CP-40; загартований до 40,0 ° С, Брукфілд, США). За наявності достатньої кількості зразкового матеріалу проводили подвійні вимірювання. У п’яти тварин на момент взяття проб у клубовій кишці не було дигести.
Для фіксації (20 годин при кімнатній температурі) у модифікованому розчині Буена (4% пікринової кислоти + 2,5% ацетату міді + 3,5% формолу) зразки тканини розтягували на пробкові пластини з їжачковими шипами. Потім було кілька промивань 70% етанолом протягом 24 годин. Препарати далі зневоднювали протягом 48 годин за допомогою зростаючого спиртового ряду (4 рази 2 години 80%, 30 хвилин 90%, 2 рази 30 хвилин 96%, 4 рази 1 годину 100% етанол; освітлення ксилолом I, II та III 20 хвилин кожного разу; кожен раз при кімнатній температурі). Після купання в м'якому парафіні з температурою плавлення 46 ° C зразки вкладали в твердий парафін при 60 ° C (температура плавлення 57 ° C).
Зразки тканин розміром близько 1,5 см², розтягнуті на пробкових пластинах, фіксували на 24 години у наступному розчині: 2% параформальдегіду + 2,5% глутаральдегіду в 0,1 М какодилатному буфері, рН 7,2. Потім їх кілька разів промивали промивним буфером, згаданим у розділі 3.4.2, і після цього фіксували відповідним розчином тетроксиду осмію протягом 2 годин при кімнатній температурі. Після багаторазового промивання зразки промивали висхідною серією спиртів (2 рази 30 хвилин 50 і 70%; 30 хвилин 80% етанолу I, 16 годин 80% етанолу II, 2 рази 30 хвилин 90 і 96% і 4 рази 30 хвилин 100 % етанолу; кожен при 4 ° C) зневоднений. Після цього проводилася 2-годинна обробка HMDS (1-1-1-3-3-3 гексаметилдисилазаном; Roth 3840.2) при кімнатній температурі, перш ніж препарати випаровувались за ніч (кімнатна температура). Після того, як препарати були приклеєні до пластин для зразків з використанням струмопровідного олова (Plano), їх зберігали у вакуумній шафі до розпилення (одна хвилина; Sputter Coater S150B, Edwards Company, England).
Оглядове фарбування, а також докази проліферації та апоптозу для світлової мікроскопії
Для морфологічних та морфометричних досліджень зрізи товщиною 5 мкм фарбували гематоксилін-еозином (ВІН). Крім того, зрізи однакової товщини фарбували періодичним кислотним реагентом Шиффа Альціановим синім (PAS-AB), рН 2,5. Використовувані тут барвники по-різному забарвлюють слизові речовини (муцини) в келихоподібних клітинах залежно від їх значення рН. З одного боку, це значно спрощує ідентифікацію келихоподібної клітини; з іншого боку, кислі муцини позначені синім, а нейтральні муцини - червоним (Romeis, 1989). Подальша диференціація муцинів не проводилась. Для визначення швидкості проліферації та апоптозу були проведені спеціальні докази, які окремо описані нижче.
Виявлення проліферативно активних клітин
Принцип методу виявлення Тимідиновий аналог бромодезоксиуридин (BrdU) вводили свиням інтраперитонеально протягом однієї години перед забоєм у концентрації 15 мг/кг живої маси. Протягом цієї години змінений уридин був включений в їх генетичний матеріал клітинами в S-фазі клітинного циклу. Включені brdUridines мічені моноклональними антитілами миші. Зв’язані первинні антитіла стають видимими за допомогою пероксидазно-антипероксидазного методу (PAP), імуноглобуліну кролика, який служить мостиковим антитілом (Romeis, 1989). Ядра, що містять BrdU, виглядають коричневими. Для цього використовувались такі реагенти: SILANES: Слайди покривали відповідно до інструкцій Sigma A3648. TBS I: промивний буфер I (сольовий розчин, забуференний TRIS); 0,1 M TRIS + 0,1 M NaCl + 0,05 M MgCl; pH 7,5 Інкубаційний буфер: 0,05 М TRIS + 0,9% NaCl + 0,66 мМ MgCl2 + 1% BSA + 0,1% желатину (Merck 4078) TBS II: промивний буфер II; 0,05 М TRIS + 0,9% NaCl; рН 7,6 трипсину: 0,1% + 0,1% CaCl 2 в TBS I (рН 7,6-7,8) SwNS: нормальна свиняча сироватка (DAKO X 0901); для попередньої інкубації 20% у реагентах для виявлення TBS I (інкубація): Інкубація I: MaBrdU (DAKO M 07444; моноклональне антитіло миші проти BrdU); 1:25 в інкубаційному буфері + 2% SwNS 33
Інкубація II: RaMIg (DAKO Z 0259; антитіла кролика проти імуноглобулінів миші); 1:40 в інкубаційному буфері + 2% інкубації SwNS III: PAP для миші (DAKO B 0650); 1: 250 в інкубаційному буфері + 2% SwNS BSA:
бичачий сироватковий альбумін (Roth 8076.2)
Принципи методів виявлення Під час апоптозу характерні фрагменти ДНК виникають внаслідок активності власних ендонуклеаз клітини. Однією з можливостей гістологічного виявлення цих фрагментів є можливість Gavrieli et al. (1992) описали метод TUNEL (кінцеве маркування dUTP-біотину на кінцевій дезоксинуклеотидилтрансферазі (TdT)). Він базується на специфічному зв’язуванні кінцевого ферменту дезоксинуклеотидилтрансферази (TdT) з 3'-ОН кінцями ДНК. Цей фермент з'єднує мічені біотином дезоксиуридин трифосфати (біотин-dUTP) з кінцями фрагментів ДНК. Біотин зрештою робиться видимим за методом PAP. Використовуваний тут комплекс стрептавідин-біотин, до якого хімічно пов'язані пероксидази, замінює антитіла (Gavrieli et al., 1992). В іншому способі виявляється наявність ферменту, типового для апоптозу, каспази-3. Ферменти в цитоплазмі позначаються за допомогою специфічного антитіла кролика. Первинні антитіла стають видимими за допомогою вже згаданого методу PAP. Мостикове антитіло, що використовується в цьому випадку, походить від кози.
Реагенти, використані для TUNEL, були такими: TBS: 0,05 М TRIS-HCl (pH 7,6) + 0,9% NaCl TdT-буфер: 30 мМ TRIS + 140 мМ Na какодилат + 1 мМ CoCl2; рН 7,2 ТБ буфер: 0,3 М NaCl + 0,03 М Na цитрат; рН 8,0 Біотин-dUTP: Boehringer 1093 070, вихідний розчин (50 нМ/50 мкл), розведений 1:10 PBS; використовуваний розчин 5 нМ/50 мкл (зберігається порціями при -20 ° C) TdT:
Boehringer 220 582, вилочкова залоза теляти; Оригінальний розчин (500 ОД/20 мкл), розведений 1:25 50% гліцерином у PBS; використовуваний розчин 500 ОД/500 мкл (зберігається порціями при -20 ° C)
Бичачий сироватковий альбумін (Roth 8076.2; зберігання при 4 ° C)
SABC-KIT: Стрептавідин-біотиновий комплекс (DAKO K0377; зберігання при 4 ° C) DAB: 37,5 мг діамінобензидину/150 мл TBS + 70 мкл H2O2 30% протеїнкінази; FLUKA 82456; 5, 10, 15, 20, 50 або 100 мкл/мл TBS ДНКази: 0,5 Од/мкл (Boehringer Mannheim, 776785) Процедура Парафінові зрізи товщиною 3 мкм наносили на відповідні предметні стекла і просочували для виявлення проліферації. Потім препарати відбілювали в метанолі з 0,3% перекисом водню (30 хвилин), а потім промивали подвійною дистильованою водою. Для 35-го
Для виявлення каспази-3 використовували наступні реагенти: цитратний буфер: 0,01 М; pH 6,0 PBS: сольовий розчин, забуференний фосфатом; без іонів Са і Mg; рН 7,4 BSA: бичачий сироватковий альбумін (ROTH 8076,2; зберігання при 4 ° C) NSfS: нормальна овеча сироватка (DAKO X0503; зберігання при 4 ° C) ЦНС: козяча нормальна сироватка (DAKO X0907; зберігання при 4 ° C) кролики -Сироватка: DAKO X0902; Зберігання при 4 ° C DAB: 20 мг діамінобензидину/100 мл PBS + 25 мкл H2O2, 30%; рН 7,6 Використані антитіла: RahCaspase-3: Serotec AHP476 (антитіло кролика проти людської каспази-3); 1: 100 у PBS + 2,5% ЦНС + 0,1% BSA (зберігання при 4 ° C.) GaR-Ig: DAKO Z0421 (антитіла кози проти імуноглобулінів кролика); 1:20 у PBS + 1% BSA (зберігання при 4 ° C.) Кролик-PAP: DAKO Z113; 1:40 у PBS + 1% BSA (зберігання при 4 ° C)
Світло- та електронно-мікроскопічне дослідження
Світломікроскопічні дослідження проводили за допомогою аксіоскопа з Цайса, Німеччина. При дослідженні зрізів, забарвлених ВІН, на додаток до аномалій особливу увагу приділяли формі ворсинок, ходу крипти та ознакам виникнення апоптозу. Зрізи, забруднені PAS-AB (pH2,5), оцінювали з урахуванням розподілу келихоподібних клітин та значень рН муцину, що трапляються. Перед оцінкою зразків, на яких були проведені конкретні докази (проліферація та апоптоз), специфічність методу спочатку перевіряли за допомогою позитивного або негативного контролю. Згодом особливу увагу було приділено виникненню та розташуванню споруд, які слід виявити. Дослідження скануючого електронного мікроскопа проводили на пристрої компанії Bausch & Lomb, Канада, типу Nanolab 2000. Оцінку транселектронних мікроскопічних зразків проводили на приладі EM 10 CR від Zeiss, Німеччина.
було остаточно виражено в кількості проліферацій на мм окружності склепу. Крім того, загальну кількість активно ділиться епітеліальних клітин у межах певного відділу слизової оболонки розраховували шляхом множення відносної швидкості проліферації на відповідний коефіцієнт збільшення поверхні слизової через формування крипти. Отримане значення виражає, скільки проліферацій є в епітелії крипти в межах певної довжини слизової оболонки lamina muscularis. Нарешті, розрахували індекс оновлення епітелію. З цією метою встановлювали загальну кількість активно ділиться епітеліальних клітин щодо розміру поверхні ворсинок. Індекс оновлення вказує, скільки нових клітин епітелію виникає по відношенню до поверхні ворсинок [проліферація/мм ворсинкової поверхні].
Всі параметри визначали на кожній свині та на всіх трьох відділах кишечника. В окремих випадках відібрані зразки були непридатними для використання. Середнє значення було сформовано із значень одного і того ж параметра, які реєструвались кілька разів для кожної тварини та кожної секції. Щоб підсумувати шість свиней у групі, також було визначено середнє арифметичне. Порівняння окремих параметрів між групами проводили за допомогою двофакторного дисперсійного аналізу. Рівень значимості становив 0,05. Щоб врахувати ефекти сміття, коефіцієнт «Слід» був вкладений у фактор «Група». Потім був проведений тест Колмогорова-Смірнова на придатність до стандартних залишків, щоб перевірити наявність нормального розподілу. Можна прийняти нормальний розподіл для всіх параметрів. Для того, щоб вивчити відмінності в параметрах між окремими ділянками тонкої кишки, спочатку були усереднені значення всіх свиней. Потім було проведено t-тест для парних зразків, рівень значимості також становив 0,05. Аналізи проводились за допомогою комп'ютерної програми SPSS для Windows, 9.0.1, 1999.