Платформа для трансплантації кісткового мозку для дослідження ролі дендритних клітин у
Резюме
Хвороба трансплантат проти господаря є основним ускладненням після алогенної трансплантації кісткового мозку. Дендритні клітини відіграють вирішальну роль у патогенезі хвороби трансплантат проти господаря. Поточна стаття описує нову платформу трансплантації кісткового мозку для вивчення ролі дендритних клітин у розвитку хвороби трансплантат проти господаря та ефекту трансплантат проти лейкемії.
Анотація
Вступ
Алогенна трансплантація гемопоетичних стовбурових клітин (ВМТ) є ефективною терапією для лікування гематологічних злоякісних пухлин 1,2 шляхом ефекту трансплантата проти лейкемії (ГВЛ) 3. Однак донорські лімфоцити все ще здійснюють небажані імунологічні атаки на тканини реципієнта, процес, який називається хворобою трансплантат проти господаря (GVHD) 4 .
Активація донорських Т-лімфоцитів клітинами, що представляють антиген-хазяїн (PCA), є важливою для розвитку DGV. Серед APC дендритні клітини (DC) є найбільш потужними. Вони за своєю суттю здатні індукувати РТПХ завдяки своєму чудовому захопленню антигену, експресії Т-клітинних костимулюючих молекул та виробленню прозапальних цитокінів, які поляризують Т-клітини в патогенні підгрупи. DC одержувачів мають важливе значення для полегшення зародження Т-клітин та індукції GVHD після трансплантації 11, 12. Як результат, CDC стали цікавими мішенями при лікуванні GVHD 12 .
TBI необхідний для поліпшення приживлення донорських клітин. Завдяки ефекту TBI реципієнти DC активуються і виживають короткий час після трансплантації 12. Незважаючи на значний прогрес у застосуванні біолюмінесценції або флуоресценції, створення ефективної моделі для вивчення ролі реципієнтів ДК у РТПХ все ще важко.
Оскільки донорські Т-клітини є рушійною силою активності GVL, стратегії лікування із застосуванням імунодепресивних препаратів, таких як стероїди, для придушення алореактивності Т-клітин часто спричиняють рецидив пухлини або інфекцію. Тому націлювання на компакт-диски-реципієнти може забезпечити альтернативний підхід до лікування GVHD, зберігаючи ефект GVL та попереджаючи зараження.
Коротше кажучи, це дослідження забезпечує платформу для розуміння того, як різні типи сигналізації на CD-реципієнтах регулюють розвиток GVHD та ефект GVL після BMT.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Експериментальні процедури були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин Університету Центральної Флориди.
1. Індукція РТПХ
ПРИМІТКА: Трансплантація алогенних клітин кісткового мозку (КМ) (етап 1.2) проводиться протягом 24 годин після опромінення. Всі описані нижче процедури проводяться в стерильних умовах. Виконайте процедуру в капюшоні для культури тканин і використовуйте відфільтровані реагенти.
2. Модель котрансплантації
3. Моделі BMT GVHD/GVL
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Невідповідність основної моделі B6 MHC (H2k b) -BALB/C (H2k d) повністю відповідала розвитку РТПХ після трансплантації (Рисунок 2). Шість клінічних ознак РТПШ, встановлені раніше Куком та співавт. 16 траплялося у реципієнтів, яким трансплантували Т-клітини WT-B6, але не у реципієнтів, яким трансплантували лише BM (крок 1.5), які представляли групу, яка негативно впливає на РТПХ. У цій моделі є два етапи розвитку РТПЧ. По-перше, пік тяжкості становить приблизно 11 днів після трансплантації, а потім зниження клінічних показників та відновлення маси тіла до 16 днів. На цій фазі декілька механізмів, таких як запалення та синдром прищеплення, викликані променевою реакцією, викликають збудника захворювання та РТПХ. Одержувачі рівномірно піддаються РТПХ приблизно через 30-40 днів після трансплантації.
Щонайменше 85% ВМ диференціюється в CD (рис.3AT). Цікаво, що трансплантація з fB -/- DC покращила виживання реципієнтів та клінічний показник GVHD (рис.3B, C). Оскільки DC fB -/- мають меншу здатність до презентації антигену, продемонстровану нижчою експресією MHCII та зниженою експресією 17 костимулюючих рецепторів, протоколу ко-трансплантації може бути достатньо для вивчення різних звітів або мішеней на CD-реципієнтах при розвитку GVHD після BMT.
Рисунок 2: Модель B6-BALB/c GVHD не відповідає основним MHC. Мишей BALB/c фатально опромінювали і трансплантували лише 5 х 10 6 ВМ або 0,75 х 10 6 Т лімфоцитів (AT) Дані виживання, () втрата маси тіла, і (VS) дані клінічних оцінок від реципієнтів ІМ окремо або з Т-клітинами. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього показника.
Рисунок 3: Модель ко-трансплантації DC HCT. BM виділяли з мишей WT та FB -/- B6 і диференціювали в DC шляхом культивування за допомогою GM-CSF. (AT) Чистоту постійного струму досліджували методом проточної цитометрії, фарбуючи CD11c та MHCII. Фатально опроміненим реципієнтам В6 трансплантували BM (3 x 10 6/миша) плюс очищені Т-клітини (1 x 10 6/миша) від донорів FVB. Одержувачі також отримували 2 x 10 6 WT або fB -/- B6 BM-DCs клітин у день трансплантації. Виживання () та клінічний бал (VS). Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Малюнок 4: Основна MHC не відповідає моделі B6-BALB/c GVHD/GVL. Реципієнти WT BALB/c були трансплантовані TCD-BM (5 х 10 6/миша) поодинці або ACC1 - Т-клітини або ACC1 '/ Т-клітини (1 х 10 6/миша), ізольовані від донорських мишей B6. Крім того, реципієнти отримували 2 х 10 3 A20-luc під час трансплантації. Чистоту Т-клітин досліджували за допомогою проточної цитометрії шляхом фарбування живими/летальними потоковими антитілами CD8 (AT). Реципієнти контролювали ріст пухлини, що визначали за допомогою візуалізації біолюмінесценції всього тіла (BLI) (). Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Використання стовбурових клітин для конкретної людини є ефективним підходом для лікування запущених та стійких видів раку 18. Однак фармацевтичні препарати з невеликими молекулами довгий час залишаються основним напрямком персоналізованої терапії раку. З іншого боку, у клітинній терапії безліч взаємодій між донором та господарем може вирішально вплинути на результати лікування, такі як розвиток РТПХ після ВМТ 1 .
Потенційна перевага спільно трансплантованого протоколу полягає у тестуванні ролі реципієнтів DC без конкретної залежності від виснажених CD11c мишей. Оскільки генерація BM-DC проводилася ex vivo, цей протокол також може бути застосований для перевірки ролі інших типів клітин, таких як макрофаги або нейтрофіли в GVHD, просто шляхом модифікації умов культивування. Використання мишей CD45.1 та B6 як реципієнтів дозволяє дослідникам відрізнити BM-DC (CD45.2 та CD11c) від CD-реципієнтів (CD45.1 та CD11c) шляхом аналізу потоку. + Гнучка кількість клітин, створених ex vivo та прийнятих у реципієнтів трансплантатів, є ще однією перевагою протоколу спільної трансплантації. Крім того, культура ex vivo дозволяє нам фільтрувати потенційні ліки для контролю РТПХ.
Здатність слідувати моделям пухлин in vivo є потужним інструментом, який може перевірити, чи може препарат впливати на активність ГВЛ. За допомогою цієї моделі GVHD/GVL можна спостерігати за прогресуванням пухлини та метастазуванням у живих тварин 16. Крім того, цей параметр може бути використаний для тестування ефекту GVL при декількох видах раку.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Автори не мають конфлікту інтересів.
Подяка
Це дослідження підтримується стартовим грантом Університету Центральної Флориди в галузі медицини (для HN), грантом для запуску онкологічного центру Hillman Medical Center University of Pittsburgh Medical Center (для HL), грантом NIH США №1P20CA210300-01 та Міністерством В'єтнаму гранту на охорону здоров'я # 4694/QD-BYT (на PTH). Ми вдячні доктору Сюе Чжун Ю з Медичного університету Південної Кароліни за надання матеріалів для дослідження.