Порівняльне дослідження методів доставки лікарських засобів, орієнтованих на мишку внутрішньої вушної бульлостомії проти

Анотація

Ми представляємо дві малоінвазивні мікрохірургічні методики у гризунів для доставки певних препаратів у середнє вухо, щоб воно могло дістатись до внутрішнього вуха. Перша процедура передбачає прокол барабанного міхура, який називається булостомія; друга - транстимпанічна ін’єкція. Обидві клінічні процедури імітують внутрішньотимпанічну реакцію людини.

Хітозан-гліцерофосфат (CGP) та буфер Лактата Рінгера (RL) використовувались як біосумісні засоби для місцевої доставки ліків. CGP - це нетоксичний, біорозкладаний полімер, який широко застосовується у фармацевтичних цілях. Це в’язка рідина при кімнатній температурі, але вона твердне в напівтверду фазу при температурі тіла. RL - це ізотонічний розчин, який використовується для внутрішньовенного введення людям. Невеликий обсяг цього автомобіля точно розміщений над круглою нішею вікна (RW) за допомогою бульлостоми. Транстимпанічна ін’єкція наповнює середнє вухо і забезпечує менший контроль, але ширший доступ до внутрішнього вуха.

Профілі двох методів безпеки були вивчені та порівняні за допомогою функціональних та морфологічних тестів. Слух оцінювали шляхом запису відповіді слухового стовбура мозку (ABR) до і кілька разів після мікрохірургічного втручання. Рівень кохлеарної цитоархітектури та структури збереження вивчали стандартними гістологічними методами у фіксованих та декальцифікованих кохлеарних зразках. Паралельно брали неприкріплені кохлеарні зразки, які негайно заморожували для аналізу профілів експресії генів маркерів запалення за допомогою кількісної ланцюгової реакції зворотної транскриптази-полімерази (qRT-PCR).

Обидві процедури придатні як способи доставки ліків у середнє вухо мишей, хоча транстимпанічна ін'єкція виявилася менш інвазивною порівняно з бульлостомією.

Вступ

Тут ми описуємо та порівнюємо два хірургічні методи, які вдосконалено для місцевої доставки ліків у внутрішнє вухо мишей. Профіль двох методів безпеки оцінювали за допомогою функціональних, морфологічних та молекулярних тестів. Слух оцінювали за допомогою реакції стовбура мозку (ABR) 26, 27, виконаної до та після мікрохірургічного втручання в різний час. Процедури кінцевої точки використовували для розтину вушної раковини та порівняння анатомічного, клітинного та молекулярного впливу цих двох мікрохірургічних процедур.

Протокол

Переконайтесь, що процедури поводження з тваринами відповідають національним та міжнародним нормам. Протокол відповідає рекомендаціям Європейського Співтовариства 2010/63/ЄС та Іспанської 53/2013 відповідно.

Поводження 1. Загальна інформація про тварин

3. Підготовка транспортного засобу

Підготувати та використовувати з транспортні рішення в з стерильні умови.
ПРИМІТКА: Рідкі розчини зазвичай швидко очищаються через євстахієву трубку. Для збільшення часу перебування препарату в середньому вусі можуть використовуватися різні ін’єкційні системи доставки, включаючи гідрогелі та наночастинки 32.
1. Для приготування CGP-гідрогелю розчинення 75% деацетильованого хітозану в 0,2 М оцтової кислоти дає 1,5-2% (мас./Мас.) Розчину хітозану. Додайте до цього розчину 9% гліцерофосфату (мас./Мас.) 7. Приготуйте розчин безпосередньо перед введенням і зберігайте гідрогель при температурі 4 ° C до використання.
  ПРИМІТКА: CGP-гідрогель є помірно в'язким, але все ще ін'єкційний при цій температурі. Нижче 4 ° C він перетворюється на тверду фазу, блокуючи її застосування. Після нанесення CGP зазнає фазовий перехід у напівтвердий гель приблизно через 15 хв при 37 ° C.
2. Аліквотний (0,5 мл) комерційний буфер RL зберігайте при температурі 4 ° C до використання.

4. Мікрохірургічні процедури

5. Морфологічна оцінка кохлеарної цитоархітектури

6. Експресія кохлеарного гена

Репрезентативні результати

Слух був перевірений ABR до і неодноразово після мікрохірургічного втручання для оцінки впливу на функцію слуху (малюнок 1А). Реєстри ABR проводили під наркозом, щоб уникнути рухів та напруження артефактів тварин і, отже, поліпшити їх відтворюваність 27. Введені внутрішньочеревно комбінації інгаляцій на основі кетаміну або ізофлурану зазвичай використовувались для знеболення тварин під час тестування ABR. Комбінація кетамін/ксилазин забезпечує короткочасну (2-3 хв) індукцію та стабільну, безпечну фазу технічного обслуговування при виконанні записів ABR. Слід зазначити, що ізофлуран може впливати на вимірювання чутливості ABR 38. Для регістрів ABR субдермальні електроди розміщуються в певних місцях. (малюнок 1B) і вимірюється електричний опір. Якщо імпеданс становить 3 кОм або більше, позиціонування електрода потрібно контролювати, щоб уникнути змін амплітуди хвилі ABR.

Миші, які протягом експерименту мали булостомічну або тимпаностомічну слухові операції, подібні до неоперованих контролів (рисунок 3) зберігся. Порогові значення ABR у відповідь на клацання та сплески тону не змінювались суттєво після мікрохірургічного втручання порівняно з базовими значеннями. Істотної різниці між підходами до булостомії та тимпаностомії не спостерігалось. Морфологічні дослідження були проведені для підтвердження правильної доставки транспортного засобу в середнє вухо та для оцінки потенційних змін, спричинених процедурами в кохлеарній цитоархітектурі. Жоден з основних кохлеарних регіонів не просив морфологічного засолення та тварин за обох процедур не мав подібної морфології всіх кохлеарних структур (Малюнок 4А). Крім того, також досліджували кохлеарні профілі для експресії про- та протизапальних генів цитокінів. Незважаючи на відсутність функціональних відмінностей у даних ABR між цими двома процедурами, бульлостомія викликала сильнішу запальну реакцію, ніж підхід тимпаностомії. (малюнок 4B).

Рисунок 1. Експериментальне проектування і з оцінка слуху. (AT) Схема експериментальної процедури. Слух оцінювали за допомогою ABR до і після мікрохірургічного втручання. кохлеарні зразки отримували через 28 днів після мікрохірургічного втручання. (B) миша, знеболена, лежачи на нагрівальній подушці в звукопоглинаючій камері, з підшкірним електродом, поміщеним в шкіру голови між вухами у верхній частині черепа (активний, позитивний); в області привушної зони під піною (опорна, негативна) і в задній частині (до підлоги). Гучномовець вільного поля розміщений на фіксованій відстані (5 см) перед правим вухом. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 3. Оцінка слуху. Еволюція порогів ABR (середнє ± SEM, дБ SPL) у відповідь на клацання (AT) і залповий тон (B) подразники, до та через 7, 14 та 28 днів після мікрохірургічного втручання у восьмитижневих самців мишей C57BL/6J. Булостомія (помаранчева, n = 11); транстимпанічна ін’єкція (синя; n = 6); невикористаний (сірий; n = 11), натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Обговорення

Тут ми демонструємо та порівнюємо два мікрохірургічні методи для цілеспрямованої доставки ліків у середнє вухо миші: булостомія та транстимпальна ін’єкція ін’єкцій. Критичні кроки, загальні для цих процедур, включають: i) оцінку слуху до і після мікрохірургічного втручання, ii) приготування однорідного розчину транспортного засобу в стерильних умовах, iii) ретельний контроль за процедурою та спостереження за температурою тіла тварин та постійною анестезією, iv ) повільне накопичення відповідного обсягу транспортного засобу, націленого на РАВ, і iv) взяття проб кохлеарної системи для повного молекулярного та морфологічного аналізу.

Ретроаурикулярний та вентральний підходи для бульлостомії були описані 7, 45. Ми використовували вентральне наближення, оскільки, за нашим досвідом, це призвело до меншої захворюваності та забезпечило кращий доступ до RW 46. Транстимпанічні ін’єкції, як правило, виконуються за допомогою TENSA барабанної перетинки спереду або ззаду від манубрію молотка 12. У цій роботі ми провели модифікацію техніки, ін’єкцію через pars flaccida за молотком з попереднім додатковим проколом tensa pars, щоб забезпечити евакуацію повітря під час ін’єкції.

Ін'єкція тимпаностомії була менш інвазивною, ніж бульлостомія, хоча обидві мікрохірургічні операції були швидкими (20 та 5 хв на вухо відповідно для булостомії та тимпаностомії), з часом післяопераційного відновлення та відсутністю захворюваності. Що ще важливіше, обидві процедури підтримували слух і параметри ABR були ідентичними параметрам, визначеним до мікрохірургії. Тимпаностомічний підхід займає менше часу, ніж булостомія, і його можна виконати в обох вухах однієї тварини під час однієї і тієї ж процедури. Отже, переваги ін’єкції тимпаностомії полягають у тому, що її можна виконувати двосторонній і багаторазовий, якщо це необхідно. З іншого боку, забезпечує прямий візуальний доступ булостомії до мембрани РАВ та дозволяє заповнити нішу РАВ. З іншого боку, транстимпанічний впорскування не дозволяє контролювати розміщення транспортного засобу в слоті RW.

Процедури, представлені в цій роботі, описують, як здійснити місцеву доставку препарату до середнього вуха для доклінічних застосувань, таких як оцінка ототоксичності та оцінка ефективності при втраті слуху. Описано дві мікрохірургічні процедури, які забезпечують альтернативні методи зі специфічними перевагами та недоліками. І ті, і інші зберігають слух і не викликають морфологічних змін. Місцеве запалення описується як потенційне ускладнення булостомії. Набір додаткових методів також описаний для післяопераційних процедур, включаючи оцінку слуху, морфологічних та запальних маркерів. Майбутнє застосування цих методів включає доклінічну оцінку нових методів терапії втрат, включаючи генетичний, клітинний та фармакологічний підходи, звичайно, на моделях тварин. внутрішньотимпанічні введення забезпечують доставку лікування до середнього вуха в контакті з мембраною круглого вікна, полегшуючи прохід в перилімфу без явних пошкоджень кохлеарної системи.

Подяка

Автори висловлюють подяку Genomics and Neurofunctional Noninvasive Assessment Facilities (IIBM, CSIC-UAM) за технічну підтримку. Ця робота була підтримана грантами іспанського "Ministerio de Economia y Competitividad" (FEDER-SAF2014-53979-R) та Європейського Союзу (FP7-AFHELO та FP7-PEOPLE-TARGEAR) для IVN.