Поверхнева пасивація для одномолекулярного протоколу досліджень білка (переклад на німецьку)

Резюме

Ми описуємо спосіб пасивування скляної поверхні за допомогою поліетиленгліколю (ПЕГ). Цей протокол включає очищення поверхні, функціоналізацію поверхні та покриття ПЕГ. Ми представляємо нову стратегію обробки поверхні молекулами ПЕГ протягом двох раундів, що призводить до вищої якості пасивації порівняно з існуючими методами.

Анотація

Вступ

При проведенні дослідження однієї молекули білка важливо досягти високої якості пасивації, щоб експеримент не мав будь-яких поверхнево-індукованих білкових несправностей або денатурації 1,2. Хоча скляна поверхня з поверхнево-активними речовинами, такими як бичачий сироватковий альбумін, зазвичай використовується для досліджень одномолекулярних нуклеїнових кислот 3, рівень пасивації недостатньо високий для досліджень білків. Скляна поверхня, покрита полімером (поліетиленгліколь, ПЕГ), перевершує показники пасивації 4-6. Роблячи це, його широко застосовували для досліджень білка з однією молекулою, оскільки він був введений у дослідження флуоресценції однієї молекули 7/10. Полімерним покриттям обробляють кілька обробок поверхонь 7,11,12. Отже, важко виконати всю процедуру без детальних інструкцій. Часто рівень пасивації поверхні змінюється залежно від того, який протокол дотримується. Тут ми представляємо надійний протокол з покроковими інструкціями, який усуне одне з основних вузьких місць досліджень одномолекулярних білків. Будь ласка, зверніться ілюстрація 1 для огляду.

Протокол

1. Підготовка та очищення слайдів

Мікрорідка камера складається з кварцового предметного стекла та кришки. Призмоподібна мікроскопія із повним внутрішнім відбиттям (TIRF), поверхня предметного столика зображена. Отже, важливо ретельно очистити кварцовий предметний стіл розчином H 2 O, ацетоном, КОН та піраньєю. Багатоступеневе очищення видаляє флуоресцентні органічні молекули на поверхні, які заважають вимірюванню флуоресценції однієї молекули. Крім того, травлення піраньї робить поверхню кварцу гідрофільною, утворюючи гідроксильні групи. Вільні гідроксильні групи призначені для реакції аміносиланізації на етапі 3.

Мікрофлюїдна камера складається з кварцового предметного стекла та губи кришки. При використанні мікроскопа TIRF із призмою поверхню покривного скла не знімається. Тому достатньо очистити накладку покриття лише H 2 O і KOH. У тому випадку, якщо потрібно зробити знімок покривного покриття (наприклад, за допомогою мікроскопії TIRF цільового типу), рекомендується обробити покривне покриття розчином піраньї (етап 1.7). Зверніть увагу, що якщо ПЕГилирование верхньої поверхні не є якісним, воно може діяти як заглиблювач для білків і призвести до коливань концентрації білка.

  1. Змийте H 2 O. Помістіть кришки (24 x 30, 24 x 40 або 24 x 50 мм 2) у скляну кювету. Зазвичай від 5 до 15 кришок кладуть в одну посудину. Промийте кришки 3 рази MilliQ H 2 O
  2. Очищення за допомогою КОН. Замініть воду на 1 М КОН і обробляйте ультразвуком покришки на 20 хвилин або довше.
  3. Змийте H 2 O. Промийте покривні склянки 3 рази MilliQ H 2 O, щоб видалити сліди KOH. Перейдіть до кроку 3.

3. Аміносиланізація фольги та покривних склянок

Функціоналізація поверхні кварцових предметних стекол та покривних предметів амінною групою за допомогою хімічної хімії аміносиланізації. Метанол використовується як розчинник, а оцтова кислота як каталізатор реакції аміносиланізації.

  1. Змити метанолом. Замініть MilliQ H 2 O у посуді для фарбування (з КРОКІВ 1 і 2) метанолом. Тримайте предметні стекла та кришки в метанолі до кроку 3.3. Оскільки домішки в метанолі фольга і кришка ковзають у метанолі протягом непотрібного тривалого часу (наприклад, кілька годин) адсорбуються на поверхні.
  2. Приготуйте розчин аміносиланізації.
    1. Промийте колбу Pyrex кілька разів метанолом. Ультразвуковують колби метанолом протягом 5 хвилин або довше. Рекомендується мати спеціальний поршень, який підтримується в чистоті.
    2. Додайте в колбу 100 мл метанолу.
    3. 5 мл оцтової кислоти.
    4. 3 мл APTES (3-амінопропілтріметоксисилан) і обережно струсіть.
  3. Аміносиланізація. Замініть метанол у посуді, що містить фарбуючі предметні стекла та кришки, реакційною сумішшю аміносиланізації.
    1. Інкубація протягом 20-30 хв. Під час інкубації обробляйте ультразвуком один раз протягом 1 хв.
  4. Змити метанолом. Замінити реакцію ейніносиланізації на метанол. Викиньте метанол і додайте новий розчин метанолу. Повторіть цей процес тричі.

4.Пасивація поверхні за допомогою полімеру (перший раунд)

Пасивують покриту аміном поверхню кварцових предметних стекол та покривних склянок шляхом кон'югування складного ефіру NHS з поліетиленгліколем (ПЕГ). Цю реакцію проводять протягом ночі з концентрацією насичення розчину ПЕГ при рН 8,5.

Зберігайте ПЕГІльовані предметні стекла та покривні склянки в N 2 при -20ºC.

  1. Сушки та гіпки. Акуратно розберіть предметне скло та накривку, перемістивши накривку в один бік, промийте їх MilliQ H 2 O і висушіть N 2.
  2. Збережіть слайди та обкладинки. Для негайного використання дотримуйтесь процесу другого раунду ПЕГилювання (крок 6). Щоб зберегти на більш тривалий проміжок часу, виконайте наступні дії.
    1. Помістіть пару предметного стекла та накладки на кришку в тубу об’ємом 50 мл так, щоб ПЕГильовані поверхні були звернені один до одного.
    2. Частково закрийте трубку, пропилососіть трубку та заповніть її N 2. Ці дії допомагають зберегти ПЕГильовану область протягом тривалого періоду часу. Щільно закрутіть шланг і зберігайте при -20 ° C. Якість фольги залишається гарною протягом 3 місяців (Малюнок 3, праворуч).

6. Пасивація поверхні з використанням полімеру (другий раунд)

Ще один раунд ПЕГилювання, щоб зробити шар ПЕГ щільнішим, а також загасити будь-які залишені аміногрупи на поверхні. Використання коротких молекул складного ефіру ПЕГ (333 Да) буде ефективним для проникнення в існуючий шар ПЕГ. Рекомендується зробити цей другий раунд PEGylation безпосередньо перед тим, як робити слайд-шоу.

  1. Приготувати реакційний буфер. Приготуйте свіжий 0,1 М гідрокарбонатний буфер (рН 8,5). Також можна використовувати заморожений розчин з кроку 4.2.
  2. Приготуйте розчин ПЕГилювання. Розчиніть 7 мкл 250 мМ MS4-PEG у 63 мкл бікарбонатного буфера натрію.
  3. ПЕГІЛУВАННЯ. Виконайте ту ж процедуру, що і на кроці 4.4. Інкубація від 30 хвилин до ночі.
  4. Сушки та гіпки. Демонтуйте пару предметних стекол та кришку, промийте їх MilliQ H 2 O, висушіть N 2 і зберігайте в чистій коробці з піпетками. Щоб зібрати мікрорідку камеру, перейдіть до кроку 7.

7. Зберіть мікрорідку камеру

Зберіть мікрожидкостну камеру з парою кварцового предметного стекла з ПЕГ та кришки. В якості розпірки використовується двостороння стрічка. Камера герметична епоксидною смолою, завдяки чому розчини вводяться через отвори в кварцовій предметній шафі.

Кварцові слайди з вторинної переробки. Використані фольги переробляються шляхом видалення накладок та двосторонньої клейкої стрічки.

  1. Після використання камери зберігають у водопровідній воді. Тривала інкубація у воді полегшує демонтаж камер.
  2. Прокип’ятіть камери в водопровідній воді за допомогою мікрохвильовки. Використовуйте склянку Pyrex. Варити 10 хвилин і більше.
  3. Візьміть покривні склянки та двосторонній скотч лезом бритви. Ви натискаєте кварцовий предметний скло не перпендикулярно його площині. Інакше вона зламається. Тримайте лезо бритви поза каналом. Не хвилюйтеся, інакше це подряпає канал.
  4. Промийте предметне скло побутовим миючим засобом, потерши їх пальцями.
  5. Вставте скляну кювету. Зазвичай в одній посудині може бути від 5 до 15 предметних стекол. У 10% побутових засобів для чищення та обробці ультразвуком гірок протягом 20 хвилин або довше. Змийте великою кількістю водяних гірок.
  6. Перейдіть до кроку 1.2.

Репрезентативні результати

Після розташування мікрожидкостної камери (кроки 7.1 - 7.6) та перед виконанням кроку 7.7 доцільно провести контроль якості поверхні ПЕГ.

Якщо поверхневу пасивацію було виконано успішно, спостерігається менше 10 неспецифічно адсорбованих білків на ділянку візуалізації (25 мм х 25 мм), коли флуоресцентно мічений білок 1-10 нМ (Малюнок 3, ліворуч) покласти в камеру.

Якщо один із етапів очищення або реакції здійснюється неправильно, кількість неспецифічно адсорбованих білків збільшується, і екран ПЗС може насичуватися флуоресцентними сигналами. Наприклад, якщо пропустити травлення піраньї, спостерігається 100-кратна кількість неспецифічної адсорбції (Рис. 3a, з посередині ліворуч порівнювати). Якщо пропустити другий етап ПЕГилирования, спостерігали приблизно в 3 рази більшу кількість неспецифічної адсорбції (Малюнок 3b). Низький ступінь ПЕГилювання спостерігався, коли хімічні речовини, яким минув термін дії (наприклад, APTES зберігали при кімнатній температурі протягом декількох місяців) (дані не наведені). Якість поверхні також падає, якщо з часу існування ПЕГильованого типу пройшло значну кількість часу (Малюнок 3a, подивитися. Ліворуч С право).

Наскільки нам відомо, вперше було запроваджено два раунди ПЕГилювання для досліджень однієї молекули. Два раунди ПЕГилювання гарантують найвищу якість формування шару ПЕГ (Малюнок 3b). Чудовий тип подвійного ПЕГилювання продемонстровано у фільмах (пор. 1а фільм С Фільм-1b). У цих плівках фонові сигнали від флуоресцентних молекул, що спостерігаються в розчині, використовуються набагато слабкіше, ніж подвійне ПЕГилирование, це означає, що тим самим білки відштовхуються подвійним ПЕГильованим шаром. Незважаючи на те, що настійно рекомендується двоетапна процедура, другий етап ПЕГилирования можна пропустити, якщо ваш експеримент допустимий для неоптимальної пасивації.

досліджень
Ілюстрація 1:. Схема обробки поверхонь (а) очищали предметне скло ацетоном, КОН та розчином піраньї. Він функціонує ПЕГ за допомогою APTES та ефіру ПЕГ-NHS. (B) Накладка покриття очищається КОН та, за необхідності, розчином піраньї. Він функціонує ПЕГ за допомогою APTES та ефіру ПЕГ-NHS.

fig2highres.jpg "width =" 500 "/>Малюнок 2:. Мікрорідка камера (а) Одноканальна камера. У предметному склі мікроскопа просвердлено два отвори. Він кріпиться на ковзанні з двома стеклами двостороннього скотча. (B) Триканальна камера. У предметному склі мікроскопа просвердлено шість отворів. Він кріпиться з накладкою на чотири панелі двостороннього скотча.

досліджень
Малюнок 3: ПЗЗ-зображення із міченими барвником білками, записаними в розчині. (A) ПЗЗ-зображення реєстрували в розчині за допомогою призматичної флуоресцентної мікроскопії із повним внутрішнім відбиттям із об'єктивом 60X із 10 нМ Cy3-міткою Rep. (Зліва) A-поверхня була створена відповідно до протоколу цієї статті. (Середній) Одна поверхня була підготовлена ​​до червоного згідно з протоколом у цій статті, але пропущена травлення піраньї. (Праворуч) Поверхня A була підготовлена ​​відповідно до протоколу, викладеного в цій статті, і зберігалася протягом 3 місяців при -20ºC під азотом. (B) ПЗЗ-зображення, записані за допомогою 10-нм Cy3-мітки Rep у розчині. (Ліворуч) A-поверхня створена відповідно до протоколу цієї статті. (Праворуч) Поверхня A була підготовлена ​​відповідно до протоколу цієї статті, але другий раунд ПЕГилирования був пропущений. Шкала шкали = 5 мкм.

Плівка 1: Плівки CCD з міченими барвниками білками, записаними в розчині. Плівки ПЗС були взяті в розчині за допомогою призматичної флуоресцентної мікроскопії із повним внутрішнім відбиттям із об'єктивом 60X із 10 нМ Cy3-міткою Rep. Часова роздільна здатність - 100 мс. (A) Поверхня була зроблена відповідно до протоколу, представленого в цій статті. (B) Поверхня A була підготовлена ​​відповідно до протоколу, викладеного в цій статті, але другий раунд PEGylation був пропущений. Клацніть тут, щоб переглянути фільм-1а, і натисніть тут, щоб переглянути фільм-1b.

Обговорення

Важливі кроки в рамках цього протоколу

Перед реакцією аміносиланізації важливо зробити поверхню гідрофільною. Це було досягнуто завдяки травленню піраньї, яке створює вільні гідроксильні групи на скляній/кварцовій поверхні. Рекомендується тримати поверхню витравленого піранья на H 2 O або на повітрі протягом тривалого часу, оскільки гідрофільність поверхні виявляється і падає.

Молекули ефіру ПЕГ NHS реагують. Рекомендується робити часткові кількості та зберігати їх при -20 ° C під азотом.Термін зберігання хімічних APTES при кімнатній температурі низький. Рекомендується щомісяця замінювати його новим.

Зміни до цього протоколу

Якщо ви не використовуєте травлення піраньї з якихось практичних причин, ви можете травити KOH протягом більш тривалого періоду часу (наприклад, протягом ночі), що також призведе до впливу гідроксильних груп. Підводним каменем цього альтернативного підходу є те, що повзун стає непридатним після кількох повторень через сильні подряпини.

Часто практикується спалювання факельної факельної поверхні із скла/кварцу, що ефективно видаляє флуоресцентні органічні матеріали 7. Ця процедура була включена до цього протоколу, оскільки це зайве травлення пірань. Зверніть увагу, що ця процедура може призвести до окислення гідроксильних груп. Отже, цю процедуру не слід проводити, якщо поверхня протравлена ​​за допомогою КОН або розчину піраньї.

Коли для візуалізації однієї молекули використовується буфер з рН нижче 7, конформація змінюється з ПЕГ "гриб" на "кисть", вказуючи ступінь пасивації. Тому, якщо використовується рН нижче 7,0, рекомендується обробляти поверхню тартаратом дисукцинімідилового ефіру 7.

Перспективи

Ця робота забезпечила надійний протокол для досягнення високоякісної пасивації поверхні. Цей протокол буде корисним для досліджень флуоресценції однієї молекули, в яких беруть участь білки 14 та 15, імунопреципітовані білками, а також білкові комплекси в клітинних екстрактах. Він широко використовується для інших одномолекулярних методів, таких як силова і крутна спектроскопія 16-спектроскопія. Він також буде використовуватися для запобігання адсорбції клітин на поверхні 17.

Протокол, наведений у цій дисертації, вимагає багатоетапної процедури. Як альтернатива доступні пасивація поверхні ліпідом-ПЕГ-8 та полілізином-ПЕГ-9. Оскільки вони не потребують хімічних реакцій, їх легко здійснити. Однак ступінь пасивації не такий високий, як той, який досягається хімічною модифікацією поверхні.

Розкриття інформації

Нам нічого розкривати.

Подяка

SDC, ACH та CJ були підтримані стартовими грантами (ERC StG ​​- 2012-309509) від Європейської дослідницької ради. J.-MN підтриманий Національним науковим фондом (NRF) (2011-0018198) Корея; та Програма дослідницького центру Pioneer (2012-009586), що фінансується Корейським національним фондом фінансів через Міністерство науки, ІКТ та планування майбутнього (MSIP). Цю роботу також підтримав Центр охорони здоров’я BioNano-Guard MSIP Korea як глобальний прикордонний проект (H-GUARD_2013-M3A6B2078947). YKL та J.-HH були підтримані Програмою наукових стипендій Сеула міста Сеул, Корея. Помічений білок Rep був щедрим подарунком від Dr. Суа Мьонг.