Позначення білків Як вибрати тег для вашого білка

Сара Клінк

Дата публікації: 7/2019; tpub_215

Анотація

Позначення білка - важливий аспект аналізу білка. Можливість позначення білка різними програмами, включаючи очищення, випадаючі аналізи, імуноаналізи та інше, може допомогти вам визначити функцію білка. Але який тег вибрати? Ця стаття висвітлює декілька варіантів міток та реагентів на основі спорідненості або репортерів, які можуть допомогти вам у ваших експериментах.

Вступ

Білки або поліпептиди є невід'ємною частиною клітинної функції. Вони є ферментами, які складають шляхи для енергетичного обміну, клітинного росту, передачі сигналів, мітотичного циклу та загибелі клітин. Можливість виділення та виявлення конкретних білків дозволяє зрозуміти, які білки входять до складу більших комплексів, які білки взаємодіють та їх роль у клітинній функції та засобах захворювання. Одним із способів вивчити функцію білка є додавання мітки до цікавого білка та відокремлення його від клітинного лізату для вивчення білка.

Злиті мітки можуть бути поліпептидами, малими білками або ферментами, доданими до аміно (N) або карбокси (С) кінця білка. Позначення можна здійснити шляхом клонування у вектори або додати за допомогою редагування гена CRISPR-Cas9 для позначення ендогенного білка. Використовуючи мітку афінності, ви можете виділити або іммобілізувати білок для додаткових протеомічних досліджень.

Хоча дослідники зазвичай мітять білок, щоб очистити його від клітинного лізату та використовувати ізольований білок у біохімічних аналізах, пептидна мітка може зробити більше. Наприклад, білки, мічені епітопом, можна виявити за допомогою міток специфічного антитіла, якщо антитіла, специфічні для вашого білка, відсутні. Крім того, мітки також можуть визначати кількість білків, вивчати білкові комплекси та визначати, знаходиться білок всередині клітини або поза нею. Ви навіть можете візуалізувати розташування білка в клітині через мітку на вашому білку.

Отже, яка білкова мітка підходить для ваших експериментів? Нижче наведено перелік варіантів позначення білків інструментами, які можуть допомогти.

Полігістидини

Однією з найпростіших і найменших міток є мітка полігістидину або мітка 6XHis. Як правило, ця пептидна мітка складається з шести амінокислот гістидину, які можуть бути розміщені на N або C кінці білка. Через свій невеликий розмір мітка His, як правило, не змінює структуру білка, що корисно для подальших досліджень. Крім того, мітка His може зв'язуватися з іонами металів, такими як Ni 2+, Zn 2+ і Cu 2+, що робить її корисною для очищення або іммобілізації злитих білків.

Полігістидинова мітка добре працює для швидкого очищення білків, що експресуються в кишковій паличці, але для білків, експресованих у клітинах ссавців або комах, більша кількість залишків гістидину означає, що існує більш високе фонове зв’язування. Отже, для підвищення чистоти білка металеві смоли, які пов'язують білки, мічені His, потрібно ретельно промивати. Крім того, денатуративні агенти, такі як 8М сечовина або 6М гуанідин HCl, можуть використовуватися з меченою His-мембраною або нерозчинними білками для поліпшення очищення.

Щоб додати мітку His до вашого білка, клонуйте ORF у вектор, який несе мітку. Залежно від використовуваного промотору, експресуйте мічений білок у клітинах бактерій, ссавців або комах. Як варіант, ви можете використовувати безклітинні експресійні системи для експресії білка. Для очищення білка можна використовувати магнітні кульки (наприклад, систему очищення білка MagneHis ™) або немагнітні смоли (наприклад, систему очищення білка HisLink ™) для клітинних лізатів. Якщо ваш білок з міткою His експресується в системі кроликового ретикулоцитарного лізату, система очищення білка MagZ ™ корисна для очищення білка з мінімальним гемоглобіном. Після вилучення з матриці очищення ваш мічений білок готовий до подальшого дослідження.

Очищення білка з міткою полігістидину

позначення

Глутатіон-S-трансфераза

Глутатіон-S-трансфераза (GST) - мітка афінності, яка використовується для білків, експресованих в E. coli, для очищення мічених білків від бактеріальних лізатів. Ця пептидна мітка 26 кДа є частиною сімейства цистолічних білків, присутніх в еукаріотів, що робить її менш корисною при спробі виділити білки з еукаріотичних клітин через конкуренцію з боку інших білків. Позначення еукаріотичних білків GST підвищує розчинність злитого білка, коли виражається в бактеріях. Крім того, білки з міткою GST можуть експресуватись на високому рівні в бактеріях, але можуть утворювати тіла включення завдяки агрегації білка. Тег GST може бути доданий до N або C кінця цікавого білка.

GST має сильну спорідненість до глутатіону, тобто ви можете захоплювати злиття білків GST на іммобілізованій матриці, як намистини, покриті глутатіоном. Ця характеристика зв’язування використовується для очищення білка, а також для захоплення білків, які можуть зв’язуватися з вашим білком (наприклад, аналізи, що розкладаються).

Хоча білки з міткою GST можуть бути високоекспресованими та більш розчинними, великий розмір мітки може перешкоджати функції білка в подальших додатках. Можливо, ви зможете відщепити білок від мітки GST, зменшуючи можливі функціональні перешкоди. Якщо експресований білок агрегується в тіло включення, очищення спорідненості за допомогою глутатіону стає проблематичним. GST потрібно правильно скласти для успішного зв’язування з глутатіоном, і навіть якщо мітка GST буде повторно складена, ваш цікавий білок може не бути.

Щоб використовувати тег GST, почніть з клонування області кодування для цікавого білка у вектор і експресуйте мічений білок в E coli. Використання індуцибельного промотора для контролю експресії цільового білка може допомогти з білками, токсичними для бактеріальних клітин. Після того як бактеріальні клітини лізуються (наприклад, за допомогою реагенту для лізису клітин FastBreak ™), ви можете очистити GST-мічений білок, використовуючи смолу на основі глутатіону (наприклад, систему очищення білка MagneGST ™). Залежно від використовуваного вектора клонування, може бути місце розщеплення протеази для видалення мітки GST з вашого білка. Після того, як ваш білок буде елюйований або розщеплений, він готовий до аналізу.

Очищення злиття білка GST

Білок HaloTag®

Хоча мітки GST та 6XHis корисні для виділення білків, експресованих у бактеріальних клітинах, існують варіанти мічення, сумісні як з кишковою паличкою, так і з клітинами ссавців. Білок HaloTag® 34 кДа забезпечує гнучкість цієї експресійної системи. На відміну від інших міток, які використовують нековалентні взаємодії для очищення білків, основою технології HaloTag® є ковалентне зв'язування між білком HaloTag® та його лігандом. Завдяки міцності ковалентного зв’язку ви можете промити мічений білок у жорстких умовах і в основному усунути будь-який неспецифічний білковий фон. Турбує розмір мітки, що впливає на функцію вашого білка? Нема проблем! Просто використовуйте протеазу TEV для відщеплення білка від HaloTag, а очищений білок без міток готовий до використання в подальшому аналізі.

Однією з проблем експресії білків у бактеріальних клітинах є розчинність. Евкароїтні білки не метилюються і не мають інших посттрансляційних модифікацій при синтезі в E. coli, що робить їх схильними до утворення тіл включення. Злиті мітки, такі як білок HaloTag®, можуть зробити рекомбінантні білки більш розчинними і навіть посилити експресію в бактеріях, полегшуючи очищення цікавого білка. Виражаючи злиття білка HaloTag у клітинах ссавців, будуть присутні посттрансляційні модифікації, які ближче відображають, як білок буде функціонувати в клітинних умовах. Використовуючи іммобілізовану матрицю, подібну смолі, вкритій лігандом HaloTag®, ви можете очищати лише білки з наявним HaloTag або використовувати у випадаючих аналізах для виявлення того, який білок або білки зв’язуються з вашим цікавим білком. Таким чином, ви можете краще зрозуміти взаємодію білків.

Але додатки не зупиняються на білках: взаємодія білків та очищення білка. Якщо ви хочете дослідити, з якою послідовністю ДНК пов'язується ваш білок, технологія HaloTag® може допомогти розшифрувати взаємодію білка: ДНК. Що використовувати імунохімію? У нас для цього є антитіло. Вас цікавить візуалізація клітин? За допомогою вашого білка, злитого з білком HaloTag® та флуоресцентними лігандами HaloTag®, ви зможете дізнатись, де локалізований ваш білок, чи піддається торгівлі та як швидко він перевертається. Існують навіть ліганди для мікроскопії з надвисокою роздільною здатністю та FACS. Дізнайтеся більше про технологію HaloTag® тут.

Щоб розпочати роботу з технологією HaloTag®, клонуйте область кодування для вашого білка, що цікавить, у традиційних векторах клонування або Flexi®, щоб додати HaloTag на кінці N або C. Крім того, ви можете шукати будь-який з тисяч попередньо побудованих клонів HaloTag®, доступних у Kazusa. Отримавши свій клон, ви можете використовувати його для будь-якої програми аналізу білка. Залежно від того, що ви хочете зробити далі, вам може знадобитися система очищення (наприклад, система очищення білка HaloTag® від ссавців або система очищення білка HaloTag®) або висувний тест (наприклад, HaloTag® системи ссавців для ссавців). Для візуалізаційних досліджень вам потрібно буде вибрати правильний флуоресцентний ліганд (наприклад, ліганди HaloTag® або ліганди Janelia Fluor® HaloTag®). Якщо ви зацікавлені в імунологічних дослідженнях, допоможе анти-HaloTag® pAb. Для взаємодії білків існує система NanoBRET ™ PPI для білка: дослідження взаємодії білків та система HaloCHIP ™ для вивчення білка: взаємодія ДНК.

Технологія взаємозамінного маркування HaloTag®

Рисунок 1. На цій ілюстрації показано, як білок HaloTag® зливається з цікавим білком та ковалентним зв'язуванням між HaloTag та його лігандом.

Хоча більшість розглянутих раніше пептидних міток є мітками спорідненості для використання при очищенні білка, випадаючих аналізах або методах, які пов'язують мічений білок із твердою матрицею, існують інші типи міток для різних застосувань. Від кількісного визначення білків до ендогенного мічення, біолюмінесцентний тег або навіть невеликий репортерний білок, злитий з білком, можна використовувати для відстеження міченого білка в клітині, усуваючи потребу в антитілах.

HiBiT

Менший для багатьох речей, а крихітна 11-амінокислотна мітка під назвою HiBiT чудово підходить для мічення білка. Якщо ви хочете пропустити традиційне клонування, ви навіть можете скористатися редагуванням гена CRISPR, щоб додати тег HiBiT до ендогенного білка. Це має перевагу у вивченні білка без надмірної експресії, яка зазвичай спостерігається при використанні екзогенної експресії з плазміди. Зберігаючи клітинні білки в тих самих пропорціях, що і в клітині, ви зможете вивчити зміни у своєму міченому білку у фізіологічних умовах. Ця перевага означає меншу кількість артефактів від надмірної експресії білка та більш біологічно важливі результати. Протокол CRISPR для додавання пептидного тегу простий і малий, якщо HiBiT пропонує високу ефективність редагування.

HiBiT сам по собі не є біолюмінесцентним. Однак після додавання реагенту для виявлення, який містить комплементарний білок LgBiT, виробляється яскравий люмінесцентний сигнал. Кількісно вимірюваний сигнал легко виміряти за допомогою люмінометра. Біолюмінесцентні аналізи чутливі і пропонують виявлення до наномолярних рівнів. Хочете вивчити позаклітинні або секретуються білки? Для цього у нас є система реагентів! Поєднуйте визначення загального міченого білка з нашою літичною системою та вивчайте рівень секретованого білка, використовуючи нашу позаклітинну систему.Ви навіть можете усунути потребу в антитілах і скористатися нашою біолюмінесцентною блот-системою для виявлення білків, що потрапили в мембрану. Якщо LgBiT експресується внутрішньоклітинно, ви можете кінетично виявити кількість білка, міченого HiBiT, у живих клітинах. Подивіться, як ви можете використовувати HiBiT для мічення білків тут.

Щоб почати використовувати HiBiT, ви можете клонувати свій ORF в один із наших традиційних векторів MCS або Flexi® або використовувати метод CRISPR для додавання мітки до геномної послідовності. Помістіть тег там, де це потрібно для оптимального виявлення. Після того, як ваш білок позначений HiBiT, визначте, який метод найкраще підходить для ваших досліджень (Nano-Glo® HiBiT Lytic, внутрішньоклітинна система або система блотування).

Огляд системи літичного виявлення Hi-BiT Nano-Glo®

Люцифераза NanoLuc®

Іноді підходить лише репортер. На щастя, люцифераза NanoLuc® - це фермент 19 кДа, завдяки чому біолюмінесцентний білок стає досить малим, щоб зв’язатись з іншим білком, не втручаючись у нормальні клітинні функції. Подібно до HiBiT, NanoLuc забезпечує чутливу мітку злиття білків, яка легко вимірюється. Однак фермент-репортер не вимагає доповнення партнера, що спрощує його використання в деяких додатках. Яскравість і малі розміри означають, що люцифераза NanoLuc® може вміщуватися у вірусні частинки, не створюючи труднощів. Прочитайте, як це зробили ці дослідники вірусології. Як фермент-репортер, люцифераза NanoLuc® може допомогти виявити клітинне розташування злитого білка, а також відстежувати шлях, яким може пройти ваш білок. Крім того, злиті білки NanoLuc® можуть бути використані в додатках, що базуються на біолюмінесцентному резонансному переносі енергії (BRET), для вивчення білків: взаємодії білків або взаємодії з мішенями малих молекул. Дізнайтеся більше про можливості цього ферменту-репортера.

Щоб створити злиття білка з люциферазою NanoLuc®, вам потрібно буде клонувати ORF у репортерний вектор NanoLuc®, розміщуючи NanoLuc на кінці N або C. Залежно від вашої програми, ви можете використовувати систему літичного виявлення (наприклад, систему аналізу люциферази Nano-Glo®) або тест виявлення живих клітин (наприклад, систему аналізу живих клітин Nano-Glo®).

Резюме

Вибір мітки для вашого білка базується на ваших експериментальних потребах. Якщо вам потрібна мітка спорідненості для очищення білка, чи хочете ви створити єдиний злитий білок, який буде використовуватися в різних методах аналізу білка, чи додасте ендогенну мітку за допомогою редагування гена CRISPR-Cas9, є цілий ряд тегів та репортерних ферментів.