Профіль біологічної сумісності на біоматеріалах для протоколу регенерації кісток (переклад на
Резюме
Кількість нових біоматеріалів, призначених для відновлення великих пошкоджень кісток, постійно розширюється з метою покращення загоєння кісток та подолання ускладнень, пов'язаних з трансплантацією кісток. Тут ми представляємо мультидисциплінарну стратегію доклінічного тестування на біосумісність біоматеріалів для відновлення кісток.
Анотація
Вступ
Відновлення кісток - це складний процес, який починається з утворення гематоми, запалення, утворення мозолі, а потім реконструкції 1, 2. Однак потенціал регенерації кістки обмежений розміром перелому кістки 1, 3. Наприклад, великі переломи кісток, спричинені травмою, раком або остеопорозом, неможливо вилікувати і називаються незрощеними переломами кісток. Ці ураження кісток часто вимагають лікування для сприяння здоровій фізіологічній регенерації та відновленню кісток. В даний час аутотрансплантація та алогенна трансплантація кісток є підходом вибору 4 із 2,2 мільйона процедур заміщення кісток на рік 5. Хоча ці процедури мають високий рівень успіху, можуть бути ускладнення, наприклад, обмежена доступність кісток, інфекція, захворюваність та відторгнення на місці донора 4. Для вирішення цих проблем шукаються нові альтернативи інженерії кісткової тканини.
Дизайн біоматеріалів на основі природних або синтетичних полімерів, біокераміки або металів у поєднанні з біоактивними клітинами та молекулами зростає 6. Наше сучасне розуміння фізіологічного загоєння та загоєння кісток у контексті біоматеріалів залежить від різних факторів, таких як механічні властивості та багато місцевих та системних факторів, включаючи циркулюючі клітини та місце перелому 7, 8, 9. Біоматеріали для регенерації кісток спрямовані на сприяння остеогенності та остеоінтеграції 10 і є ідеально біосумісними та біологічно розкладаються пористими (сприяючи міграції поживних речовин, кисню та клітин). Вони також повинні бути досить міцними, щоб підтримувати місце перелому для полегшення болю. Крім того, для ініціювання процесу загоєння потрібні запальні фактори. Однак, якщо біоматеріал викликає надмірне запалення та алергічні реакції, він може обмежити або пригнічити загоєння кісток 11, 12. Таким чином, необхідний міждисциплінарний підхід для оцінки біоматеріалів, призначених для відновлення кісток.
У цьому дослідженні ми представляємо доклінічну оцінку репрезентативних матеріалів, 1) піна Orthovita Vitoss, яка є комерційно доступним замінником кісткового трансплантата, що складається з трикальцію фосфату, що складається з нанорозмірних чистих частинок β трикальцію фосфату (β-TCP) та бичачого типу 1 ( В) колаген (β-TCP/C піна) і 2) β-TCP диски. Тут ми ілюструємо аналіз біосумісності цих біоматеріалів з використанням аналізів на первинні остеобласти (OB) та остеокласти (OC), модель відновлення кісток in vivo, імунологічну оцінку, що включає проліферацію Т-клітин in vitro та вироблення цитокінів in vitro, а також імуногенність та алергенність in vivo, як раніше заявлене 13 .
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Процедури проводили з мишами BALB/c, дотримуючись усіх рекомендацій щодо догляду та використання лабораторних тварин від Міністерства освіти, науки та досліджень Австрії та схвалених Комітетом з етики міністерства Австрійської освіти, науки та досліджень.
1.Первинна ОВ Миша Культура
2. Миші OB-OC спільно культивують для отримання зрілих OC
3.критичний розмір моделі речовини миші за замовчуванням
4. імунні відповіді in vitro
5. інтраперитонеальна модель високого потоку
6. субхронічна модель підшкірної токсичності
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Для оцінки β-TCP щодо його ефективності як біоматеріалу для відновлення кісток ми використовували методи скринінгу in vitro та in vivo. По-перше, ми виміряли відповіді ОВ на дисках β-TCP порівняно з контролем лише базових значень. Малюнок 2 показує життєздатність ОВ у відповідь на диски β-TCP на 7 та 14 дні культури. Життєздатність клітин, виміряна з метаболічно активних клітин у лунках культури, однакова для ОВ із пластиковими культуральними середовищами тканин, а також з дисками β-TCP, що вказує на те, що цей біоматеріал не посилює і не пригнічує проліферацію.
Щоб продовжувати оцінювати ОВ, ми вимірювали активність ALP як маркер диференціації, використовуючи як якісний, так і кількісний підходи. Малюнок 2 ілюструє активність ферменту ALP у лунках культури через 7 днів культури. ОВ у свердловинах лише з середовищем мали базальну активність АЛП, тоді як в середній оптимальній мінералізації (ММ) ОВ мали інтенсивне фарбування АЛП, що відображає високий рівень диференціації ОВ. На відміну від них, OB висіваються на диференційовані β-TCP-диски, якщо OB не інкубуються в MM. У кількісному аналізі концентрація ALP була на 77% вищою для лунок, що містять MM, порівняно лише з базальним середовищем, тоді як концентрація ALP була на 40% нижчою в клітинах, вирощених на дисках β-TCP, порівняно з контролем. MM. Хоча ці результати демонструють, що клітини, вирощені на диференційованих β-TCP-дисках, поступаються клітинам в оптимальних пластичних умовах з ММ, достатньо розрізненими на біоматеріалах.
Іншою важливою характеристикою ОВ є їх здатність індукувати мінералізацію, що є важливим етапом у загоєнні кісток. Ми забарвили ОВ-клітини, культивовані ARS, через 14 днів і виявили, що мінералізація була вищою для контролів ММ порівняно з ОВ, вирощеними в самому середовищі та на β-TCP-дисках у лунках культури (Рисунок 2). Коли ми вимірювали концентрацію ARS, ми виявили, що контроль над ММ був на 45% вищим, ніж група β-TCP. Ці дані ілюструють, що ОВ, вирощені на пластиці у присутності зрілих ММ, диференціюються та мінералізуються краще, ніж ті, що мають одинарне середовище, та на дисках β-TCP.
Щоб визначити, як ОК реагують на диски β-TCP, ми використали технологію культивування, при якій ОВ культивують спільно з попередниками ОК з кісткового мозку з подальшим дослідженням морфології ОК. OB-OC кокультури спостерігали через 5 днів і суттєво відрізнялись між клітинами, вирощеними на пластиці з OC DM, та клітинами, вирощеними на зрізах кісток, та β-TCP. На пластиці ОК були великими та широко розповсюдженими, тоді як ОК на фізіологічних субстратах були меншими, менш розповсюдженими та неправильної форми (Рисунок 3). Для кількісної оцінки OC ми пронумерували пастку + OC і виявили, що було більше значень при інкубації в присутності β-TCP (1755 ± 21,41/см 2) порівняно з контролем (1140 ± 15,71/см 2)) культури тканин і кісток зрізи (709 ± 59,69/см 2), що передбачає посилену диференціацію OC на дисках β-TCP (Рисунок 3).
Для визначення комерційно доступної піни β-TCP/C in vivo ми використовуємо модель дефекту речовини критичного розміру у мишей. Ми демонструємо репрезентативні гістологічні зрізи, оброблені гістологічним методом вбудовування з включенням глікольметилметакрилату та фарбуванням Левай Лачко. MicroCT та гістологію можна використовувати для оцінки утворення нових кісток у ділянці дефекту. Тут ми покажемо приклад з гістологічними зрізами на малюнку 4. Коли хірургічно індукований дефект кістки залишався порожнім (фіктивним), ми спостерігали тонкий шар, який покриває будь-який дефект, але через 12 тижнів після операції не було значного утворення кістки, що підтверджувало б критичний розмір перелому створеної ОС. На відміну від цього, коли нерівність містила піну β-TCP/C, існували залишки піни β-TCP/C, оточені щільною волокнистою тканиною з деякими кровоносними судинами та запальними клітинами, що заповнювали дефектний простір без доказів.
Щоб оцінити реакцію на чужорідне тіло, ми оцінили імунологічні та алергічні реакції на біоматеріали, використовуючи тест in vitro. Малюнок 5 показує, що коли інкубують наївні спленоцити лише з середовищем або з піною β-TCP/C, наївні клітини селезінки не реагували на проліферацію або продукцію цитокінів il-2, IL-4 та IFN-γ. На відміну від цього, у культурах, що містять ConA, проліферація клітин та продукція цитокінів збільшувались, за винятком IL-1β. На реакції клітин впливали при спільному культивуванні з піною ConA та β-TCP/C порівняно з лише ConA, що вказує на те, що піни β-TCP/C ні збільшуються, ні зменшуються у відповідях in vitro.
Щоб визначити, чи індукує піна β-TCP/C імунореакцію in vivo, ми імплантували її 1) внутрішньочеревно та вимірювали концентрацію кількості запальних клітин та цитокіну в рідині для промивання очеревини та 2) підшкірно. І оцінювали запалення та фіброз на гістологічних зрізах. місця імплантації. В таблиця 1, диференціальна клітина в рідині для промивання очеревини виявляє, що загальна кількість клітин запалення була значно вищою у імплантованих мишам β-TCP/C порівняно з контролем. Крім того, збільшилася кількість усіх типів клітин. На малюнку 6 а, спостерігаються вищі концентрації цитокінів IL-1β, il-2 та IL-4 у β-TCP/C піні порівняно з контролем. У мишей β-TCP/C піни С. імплантовано, ми спостерігали запальну реакцію на гігантські клітини чужорідного тіла на ділянках, пофарбованих Н & Е (рис. 6b) та дані про фіброз на зрізах трихрому де Массона (рисунок 6) забарвлений на 8 тижні. На противагу цьому, місце імплантації фіктивних контрольних органів мало мінімальне запалення і не мало фіброзу (рисунок 6).
Рисунок 2: Індукована β-TCP диференціація та дозрівання OB in vitro. Життєздатність ОВ та проліферація через 7 та 14 днів для клітин, культивованих у середньому (бари) або β-TCP (відкриті бари) (середнє значення ± SEM; n = 3). Кількісна оцінка активності ALP клітинних лізатів, а також нормалізація вмісту білка (мкМ DIFMU/мкг білка, середнє значення ± SEM, n = 3) з репрезентативними зображеннями, що ілюструють лунки культури, пофарбовані сучасною ALP 7. Кількісна мінералізація пофарбованих культур з ARS методом екстракції цетилпіридиній хлоридом, показали, що концентрація ARS (μM ARS, середнє значення ± SEM, n = 3) з посівами в лунках ARS, пофарбованих, що представляє 14-й день. Групи включають лише середовище для росту кісток (BGM); Середнє значення мінералізації (ММ); Β-TCP. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.
Обговорення
Тут ми демонструємо мультидисциплінарний підхід до доклінічної оцінки біосумісності репрезентативних біоматеріалів, розроблених для відновлення та регенерації кісток. Ми протестували реакції ОВ, ОК та загоєння in vivo у критичній моделі миші OS, а також імунні відповіді in vitro та in vivo. Метою дослідження було продемонструвати, як працюють тести, та узагальнити дані та висновки, зроблені в результаті огляду біоматеріалів. Ми показуємо, що наша стратегія створює цінний профіль біосумісності кісткового біоматеріалу.
Активність ОВ та прикріплення були вищими на культурі пластичної тканини, ніж на тестованих дисках β-TCP. Коли ми оцінювали ОК, ми спостерігали очікувані відмінності між реакцією на пластику та кісткою, яка є фізіологічним субстратом 16. Для порівняння, кістка та β-TCP викликали подібні морфологічні зміни. Перерахування дози уловлювача для пероральної контрацепції у відповідь на диски β-TCP показало, що їх кількість значно різнилася між зрізами кісток та β-TCP. Β-TCP індукує вищу диференціацію OC, ніж на зрізах ОС. Для диференціації OC пастка є добре встановленим аналізом. Суттєвих модифікацій цього методу не вимагається. Однак для досягнення найкращих результатів важливо не інкубувати клітини занадто довго, інакше всі клітини моноцитарного походження стануть серопозитивними в пастці.
Таким чином, аналізи ОС та імунних аналізів забезпечують профіль біологічної сумісності біоматеріалу. Для реакцій ОС, ОВ та ОК на цей біоматеріал надаються попередні дані, необхідні перед тим, як продовжувати складні та дорогі експерименти на тваринах та дотримуючись принципу 3R. Імунологічні тести in vitro дають дані про реактивність антигену та цитотоксичність, що також може перешкоджати подальшим випробуванням на тваринах. Швидкі експерименти з високою пропускною здатністю дають результати щодо реакції запалення та цитокінів (наприклад, відповіді типу Т-клітин), тоді як субхронічна модель корисна завдяки даним про тривалість запалення та можливість пошкодження фіброзу. Цей новий міждисциплінарний підхід, що включає кісткову та імунну відповіді на біоматеріали, забезпечує чудову доклінічну оцінку біосумісності для майбутніх застосувань у галузі матеріалів.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.