Регуляція актинового цитоскелета в клітинах ацину підшлункової залози тирозинкіназою Так - PDF

Кафедра внутрішньої медицини Ульмського університету I керівник проф. Г. Адлер Регулювання цитоскелету актину в клітинах підшлункової залози тирозинкіназою Так Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук людини (доктор біол. Hum.) Медичного факультету Ульмського університету, представлена ​​Грітом Лінчем з Франкенберга 2002

регуляція

Виконуючий обов'язки декана: проф. Klotz 1. Доповідач: PD Dr. Лутц 2-й репортер: Dr. День закінчення: 20 грудня 2002 року

Присвята батькам, які завжди підтримували мої мрії

Зміст 1 ЗМІСТ ЗМІСТ. 1 СКОРОЧЕННЯ. 3 1. ВСТУП. 5 2. ЦІЛЬ. 19 3. МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ. 20 3.1. Матеріал і тварини. 20 3.1.1. АНТИТЕЛО. 20 3.1.2. ХІМІКАЛІЇ. 21 3.1.3. ТВАРИНИ. 21 3.2. Методи. 22 3.2.1. ІЗОЛЯЦІЯ АЗІНІВ ВІД ПАТРОКУ. 22 3.2.2. ДОСЛІДЖЕННЯ АМІЛАЗИ СЕКРЕТІЇ У СВІЖО ІЗОЛОВАНОЇ ЩУРИ АЗІНІ. 23 3.2.3. ІМУНЕФЛЮРЕСЦЕНТНИЙ ПЛЯМ. 23 3.2.4. ВИРОБНИЦТВО ЕКСТРАКТІВ БІЛКА. 24 3.2.5. ВИЗНАЧЕННЯ КОНЦЕНТРАЦІЇ ПРОТЕІНУ. 25 3.2.6. ПІДКЛІТЧОВИЙ ФРАКЦІОН. 26 3.2.7. ІМУНРЕЦІПІТАЦІЯ. 27 3.2.7. ГЕЛЕВИЙ ЕЛЕКТРОФОРЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ БІЛКІВ НА SDS-СТОРІНЦІ. 28 3.2.8. ЗАХІДНИЙ БЛОТИНГ. 29 3.2.9. ВИЗНАЧЕННЯ БІЛКІВ З АНТИТЕЛАМИ. 29 3.2.10. Індія Інкі 30 3.2.11. КІНАЗНА ДІЯЛЬНІСТЬ ТАК. 31 3.2.12. ДЕНЗИТОМЕТРИЧНА ОЦІНКА ІМУНОБЛОТІВ. 32 3.2.13. ІЗОЛЯЦІЯ РНК З АЗІНІ. 32 3.2.14. ПЕРЕВІРКА ЧИСТОТИ І ЯКОСТІ РНК. 32 3.2.15. ГІБРИДИЗАЦІЯ ГЕНОВИХ МАСИВ. 34 4. РЕЗУЛЬТАТИ. 37

Зміст 2 4.1. Регуляція на рівні білка. 37 4.1.1. ВИРАЖЕННЯ ПРОТЕІНІВ КІНАНСІВ SRC. 37 4.1.2. ТИРОЗИНОВА ФОСФОРИЛЯЦІЯ ВІД ТАК ДО СТИМУЛЯЦІЇ CCK. 38 4.1.3. КІНОТЕЙННА ДІЯЛЬНІСТЬ ТАК. 41 4.1.4. ЛОКАЛІЗАЦІЯ ТА РЕЗПРЕДЕЛЕННЯ ТАК. 44 4.1.5. ВІДПОВІДАЛЬНІСТЬ МІЖ ПОРУШЕННЯМ АКТИНУ І ТАК ДІЯЛЬНІСТЮ. 46 4.1.6. СЕКРЕЦІЯ ІЗОЛОВАНОГО АЗІНІ. 49 4.1.7. ТАК АСОЦІОВАНІ БІЛКИ. 51 4.2. Експресія гена. 53 4.2.1. ТЕСТУВАННЯ КОНЦЕНТРАЦІЙ ДЛЯ ІЗОЛЯЦІЇ РНК. 54 4.2.2. ВИРАЖЕННЯ ГЕНІВ ПІСЛЯ СТИМУЛЯЦІЇ З CCK. 55 5. ОБГОВОРЕННЯ. 60 5.1. Регуляція білків. 60 5.2. Диференціальна експресія гена. 66 6. РЕЗЮМЕ. 69 7. СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ. 71 ДОДАТОК. 83

Абревіатури 3 СКОРОЧЕННЯ Рис Рисунок Вода Подвійна дистильована вода BSA Бичача сироватка Альбумін CCK Холецистокінін CCK-R CCK Рецептор ECM Позаклітинна матриця та ін. Експеримент Експеримент FAK Фокальна адгезія Кіназа, грами IB Імуноблот IF Імунофлуоресценція IgG Імуноглобулін G IP Імуноглобулін G IP + Легкий (обидва ланцюги IgG) HRP пероксидаза хрону (пероксидаза хрону) кда кілодальтон кг кілограм М молярний хв хвилина мк моноклональний мл мілілітр мкг мікрограм N нормальний нм нанометр нм наномолярний PBS фосфатно-сольовий сольовий розчин PMSF фенілметиленсульфонілфторид фторид pk

Скорочення 16:00 пікомолярний PVDF полівінілідендифторид Pyk2 багатий на пролін тирозинкіназа 2 RT кімнатна температура SDS додецилсульфат натрію SEM стандартна помилка SH Src гомологія TBS Буферний сольовий розчин Tyr тирозин напр. наприклад

1. Вступ 12 Стик Adherens (Ohkubo et al. 1999). p120ctn не бере безпосередньої участі у взаємодії білок-білок із системою актинових ниток, оскільки він не може зв’язуватися з α-катеніном. Одним із можливих механізмів регуляції білків зонули, що злипається, є фосфорилювання тирозину, оскільки β- та γ-катенін, як і p120ctn, можуть бути фосфорильовані тирозином шляхом стимуляції факторами росту (Hazan et al. 1998; Rosato et al. 1998). P120ctn стабілізує адгезію клітинних клітин шляхом зв'язування з E-кадгерином (Yap et al. 1998); це гальмується гіперфосфорилюванням p120ctn під час мітозу (Hazan et al. 1998). Фосфорилювання тирозину в катенінах може зіграти ключову роль у стабільності або нестабільності прилипання зонули і, отже, до закріплення системи актинових ниток з плазматичною мембраною (Behrens et al. 1993). У дослідженнях на ізольованих ацинулах також спостерігалася зміна ступеня фосфорилювання p120ctn після стимуляції надмаксимальними секреторними концентраціями CCK (Leser et al. 2000).

1. Вступ 14 ФАК та паксилін, про які йдеться. Всі 3 білки були описані в інших клітинних системах як субстрати кіназ Src (Calautti et al. 1998); (Schlaepfer et al. 1999; Shen et al. 2001). Сімейство кіназ Src включає 9 білків з вираженою структурною гомологією. Більшість кіназ сімейства Src експресуються лише в гемопоетичних клітинах, де вони часто є надлишковими, як це було показано в нокаутних моделях (Smith et al. 2001). З іншого боку, кінази Src Так, Lyn, Fyn і Src повсюдно виражаються і, схоже, виконують різні ролі (Thomas et al. 1995). Src-кінази спочатку локалізуються в цитоплазмі і, як активні ферменти, зв’язуються майже виключно з клітинними мембранами. На основі гомологій послідовностей можна диференціювати загалом шість функціонально релевантних доменів з різними завданнями (рис. 3). (Браун та ін., 1996)

1. Введення 17 складеного білка, який не може бути фосфорильований (Gonfloni et al. 2000). Прив'язка субстратів до домену SH2 також важка. Існує кілька варіантів активації кіназ Src: Дефосфорилювання Tyr 527 шляхом конкурентного зв’язування фосфатазою високоафінного субстрату з доменом SH2 або SH3, завдяки чому фосфорильований Tyr 527 витісняє алостеричний активатор або модифікацію білка (наприклад, фосфорилювання серину/треоніну), який є закритим Деформація конформації. У всіх випадках білок розгортається і стає можливим автофосфорилювання домену кінази (рис. 4). Це активує кіназу. Csk описується як негативний регуляторний білок, який відповідає за фосфорилювання Tyr 527 (Brown et al. 1996).

1. Вступ 18 PTyr 527 Tyr 527 неактивний активний Рис. 4: Регуляція активності кіназ Src. У неактивній формі (зліва) білок знаходиться у сильно складеному стані. В активній формі домен SH3 відокремлюється від спіралі, багатої проліном, і домен SH2 більше не зв'язується з хвостовою областю (тепер із нефосфорильованим залишком тирозину). Активна сторона пов'язує АТФ (червоний), який утримує фосфатну групу готовою до активації. Перша реакція - це фосфорилювання залишку тирозину безпосередньо біля місця зв'язування АТФ (автофосфорилювання). Коли цей тирозин фосфорилюється, фермент максимально активується. (після Годселла 2001)

3. Матеріал і методи 20 3. МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ 3.1. МАТЕРІАЛ І ТВАРИНИ 3.1.1. Антитіла У наступній таблиці (табл. 2) наведені всі первинні антитіла/антисироватки та їх джерела. Позначення Виробник Виробник IB IP IF Так Миша, mk Трансдукція 1: 5000 Pyk2 миша, mk Трансдукція 1: 1000 Pyk2 кролик, Biomol, pk Гамбург Фосфотирозин (PY20) миша, mk Трансдукція 1: 2500 Src миша, mk UBI 1: 200 Fyn кролик, pk UBI 1: 500 Lyn Hase, pk Санта Круз 1: 500 FAK миша, mk Трансдукція 1: 1000 P120ctn миша, mk Трансдукція 1: 1000 3 5 мкг, для 350 750 мкг білка 5 мкг для 750 мкг білка 5 мкг для 650 мкг Білок 1: 1000 1: 200 Таблиця 2: Первинні антитіла Всі вторинні антитіла в поєднанні з пероксидазою були отримані від Pierce. Для фарбування імунофлуоресценції вторинні антитіла, зчеплені Alexa 488, були отримані з молекулярних зондів (Юджин, США) та зв'язані вторинні антитіла Cy3 з Dianova (Гамбург).

3. Матеріал і методи 21 3.1.2. Хімічні речовини Назва Амінокислоти (не є необхідними, MEM 100x) CCK-8, сульфатовані (CCK 25-32) Колагеназа, (CLSPA) L-Глютамін Орегон Зелений-Фаллоїдин Бичача сироватка Альбумін (BSA) Соєвий трипсин Інгібітор Виробник Life Technologies, Карлсруе Бахем, Вюбертон, Швейцарія, Cell Systems, Hamburg Life Technologies, Karlsruhe Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA Fluka, Buchs Boehringer, Mannheim Таблиця 3: Речовини Всі інші хімічні речовини були, якщо в тексті не зазначено інше, на с. А. або надзвичайно чистої якості від виробників Fluka (Buchs), Merck (Франкфурт), Roth (Karlsruhe) та Sigma (Deisenhofen). 3.1.3. Тварини Випробуваними тваринами були самці щурів Wistar інбредного штаму WAG/RijCrl (річка Чарльз, Сульцфельд). Тварин утримували в групах з максимум 3 щурами на клітку в контрольованих умовах світло-темно, з 12-годинною фазою темряви між 19:00 та 7:00. У кімнатах було кондиціонер (температура приміщення 21 ° С, вологість 55%). Тварин годували альтроміном для розведення та дотримання дієти за бажанням. В експериментах ми використовували щурів вагою 100-200 г, які голодували протягом ночі.

3. Матеріал і методи 24 заблоковані в PBS. Первинні антитіла (у PBS) інкубували або протягом 1 години при кімнатній температурі, або протягом ночі при 4 C. Скла потім промивали тричі PBS. Інкубація з вторинним флуорохром-зв'язаним антитілом або з 0,2 мкм кон'югованим фаллоїдином Oregon Green проходила протягом двох годин у темряві при кімнатній температурі. Потім предметні стекла промивали три рази перед тим, як ацини вбудовували в Mowiol (Calbiochem, Bad Soden) і наносили на предметні стекла. Аналіз плям імунофлуоресценції проводили за допомогою конфокального лазерного скануючого мікроскопа (TCS 4D, Leica, Heidelberg). 3.2.4. Виробництво білкових екстрактів Залежно від проблеми використовувались наступні буфери для лізису. Буфер лізису дезоксихолату/тритону: Трис/HCl, рН 7,5 50 мм NaCl 150 мм ЕГТА 1 мм ЕДТА 0,4 мм Тритон Х-100 1% дезоксихолат 1% (мас./Об.) Na ортованадат 0,5 мм Na- Фтор 5 мМ інгібітор трипсину сої 1 мг/мл PMSF 1 мМ апротинін 1,4 мкг/мл лейпептину 10 мкг/мл Цей буфер використовували для аналізу фосфорильованих білків тирозину та визначення активності кінази.

3. Матеріал та методи 25 буфер лізису DTT/Triton X-100 (згідно з Antibody Array, Biocat, Heidelberg): Tris/HCl, pH 7,5 15 мм NaCl 120 мм KCl 25 мм EGTA 2 мм EDTA 2 мм DTT 0,1 мм Triton X-100 0,5% Na ортованадат 0,5 мм Na фторид Na 5 мм інгібітор трипсину сої 1 мг/мл PMSF 1 мм апротинін 1,4 мкг/мл лейпептин 10 мкг/мл Цей буфер використовували для спільного імунопреципітації використовувані білкові комплекси Yes-Pyk2. Відповідні стимуляції зупиняли додаванням крижаного буфера KRH, а потім клітини гранулювали при 500 × g. Потім супернатант відсмоктували, і ацинуси ресуспендували в 200 400 мкл лізерного буфера і гомогенізували ультразвуком протягом 5 секунд. Подальша інкубація на льоду тривала 30 хвилин для виділення білково-білкових комплексів та 10 хвилин для всіх інших ізоляцій. Нерозчинні речовини гранулювали центрифугуванням щонайменше 20 хвилин при 10000xg при 4 ° С. 3.2.5. Визначення концентрації білка Вміст білка в екстрактах визначали за допомогою модифікованого методу Бредфорда з використанням білкового аналізу BioRad (BioRad, Мюнхен) та калібрувальної лінії BSA (0,7 мг/мл; 0,5 мг/мл; 0,3 мг/мл; 0, 1 мг/мл).

3. Матеріал і методи 28 3.2.7. Гель-електрофоретичний аналіз білків за допомогою буферів SDS-PAGE (згідно Lämmli 1970): 10 × SDS, що працює, буфер Tris 25 мМ гліцин 191 мм SDS 10% (мас./Об.), Що розділяє гель-буфер Tris, pH 8,8 1,5 M SDS 0,4 % Гелевий буфер для укладання Tris, ph 6,8 0,5 M SDS 0,4% 4 x SDS зразок буфера Tris, ph 6,8 250 мМ гліцерин 40% SDS 10% 2-меркаптоетанол 20% бромофенол синій 1 мг Система переривчастої Використовували електрофорез у поліакриламідному гелі SDS у модифікованій формі згідно з Леммлі 1970. Mini-Protean II (BioRad, Мюнхен) служив апаратом електрофорезу. Застосовували 20 мкг загального білка лізатів або супернатанту імунопреципітатів, які попередньо змішували з 4-кратним буфером зразків SDS і денатурували теплом (5 хв, 95 ° С). Електрофорез відбувався при постійній силі струму 20 мА в збірному гелі і 35 мА в розділювальному гелі.

3. Матеріали та методи 32 і реакцію кінази проводили з концентрацією АТФ 10 мМ при 37 ° С протягом однієї години. Усі подальші кроки були оброблені відповідно до інструкцій. Поглинання вимірювали при 405 нм (еталонна довжина хвилі 620 нм). 3.2.12. Денситометрична оцінка імуноблотів Для денситометричного порівняння міцності смуг експоновані рентгенівські плівки сканували за допомогою сканера пропущеного світла (Sharp JX-330) та аналізували за допомогою 1D програмного забезпечення від Phoretix (New Castle upon Thyne, Великобританія). 3.2.13. Виділення РНК з ацинусів Стимуляцію ізольованих ацинусів зупиняли холодним без льоду РНК-PBS, центрифугували при 1000 об/хв протягом 5 хвилин і супернатант відкидали. РНК виділяли згідно з протоколом Promega (SV Total RNA Isolation System, Promega, Mannheim). 3.2.14. Перевірка чистоти та якості визначення концентрації РНК Ізольовану РНК розбавляли водою у співвідношенні 1: 100 і поглинання вимірювали на двох різних довжинах хвиль. Концентрацію РНК розраховували на основі поглинання при 260 нм, а чистоту виділеної РНК отримували із співвідношення 260/280 нм. Розрахунок концентрації: поглинання 1 = 40 мкг/мл

3. Матеріал і методи 34 злегка змішані. Зразки завантажували в гель і розділяли при 50 В протягом приблизно 1-2 годин. 3.2.15. Гібридизація генних масивів Передгібридизація фільтрів 0,5% SDS кип’ятили, а мембрани (GF300 - GeneFilters Rat Microarrays Release 1, Res Gen, Invitrogen) інкубували з цим розчином протягом 10 хвилин при кімнатній температурі перед кожною передгібридизацією. 90 мкл ДНК сперми лосося (ssdna) кип'ятили протягом 5 хвилин при 95 ° С і короткочасно охолоджували на льоду. Потім ssdna та 120 мкл trna додавали до 12 мл буфера передгібридизації. Передгібридизацію проводили протягом декількох годин при 42 ° С у гібридизаційній печі. Буфер передгібридизації: формамід 50% SSC 6x Denhardt s 5x NaPO 4 50 мм SDS 0,5% реакція зворотної транскриптази (RT) 25 мкг РНК випаровували в кожному випадку по 11 мкл рідини в Speed ​​Vac. Для RT використовували комплект Ambion Strip-EZTM RT (Ambion, Austin, TX). 25 мкг РНК/11 мкл 2 мл Оліго (dt) від Ambion, цю суміш кип’ятять при 65 ° C протягом 5 хвилин, а потім охолоджують до 42 ° C. Потім було додано таке:

3. Матеріал та методи 35 2 мкл 10x RT буфер 2 мкл 10x dntp 1 мкл MMLV RT (зворотна транскриптаза) 2 мкл (= 20 мкці) P 33 -α datp (Amersham) RT проводили при 37 ° C протягом 1 2 годин. . Очищення кдн Спочатку для видалення РНК проводили розщеплення Н РНК-азою. Для цього до зразка додавали 1 мкл РНКази Н і інкубували при 37 ° С протягом 30 хвилин. КДНА очищали за допомогою набору для видалення нуклеотидів (Qiagen, Hilden). Після очищення зразок елюювали з колон 50 мкл ЕДТА (50 мм). Конкуренція повторюваних послідовностей кДНК Конкурентна суміш: 50 мкл 20x SSC 70 мкл 10 мМ Трис ph 8,0 45 мкл Щурячий Hybloc (1 мг/мл) (Applied Genetics Laboratories, Мельбурн, Австралія) 20 мкл 1% SDS Конкурентна суміш і очищену кдн денатурували окремо протягом 5 хвилин при 95 ° С і негайно охолоджували на льоду. Потім обидві партії об'єднували та інкубували при 56 ° С протягом 40 хвилин. Конкурентну кДНК вводили в піпетку у свіжий розчин передгібридизації та додавали до генних фільтрів. Гібридизацію проводили щонайменше 18 годин при 42 ° С в гібридизаційній печі.

3. Матеріали та методи 36 Промивання фільтрів Зразок викидали і фільтри промивали двічі протягом 5 хвилин 2 рази SSC; 0,1% SDS промивають при КТ. Потім були проведені ще два жорсткі етапи промивання при 68 ° C з 0,2 × SSC; 0,1% SDS протягом 15 хв кожного разу Матриці генів поміщали між 2 шарами фільтрувального паперу для видалення залишку рідини та загортали у фольгу. Фосфорний екран (Kodak, Штутгарт) застосовували протягом приблизно 5 днів. Сигнал сканували за допомогою фосфорного сканера (Molecular Dynamics, Amersham Biosciences, Саннівілл, Каліфорнія) та оцінювали за допомогою програмного забезпечення Array Vision 6.0 (Imaging Research).

4. Результати 37 4. РЕЗУЛЬТАТИ 4.1. РЕГУЛЯЦІЯ НА РІВНІ БІЛКА 4.1.1. Експресія білка Src-кіназ Для вивчення структури експресії білка Src-кіназ у клітинах ацинарної підшлункової залози щура, 20 мкг загального білка виділяли з ізольованих ацинусів підшлункової залози щурів та відокремлювали електрофорезом. Білок переносили на мембрану PVDF вестерн-блот і досліджували на експресію повсюдно експресованих кіназ сімейства Src. Були використані антитіла проти кіназ Так, Src, Lyn та Fyn. Так і Lyn експресуються в ацинарних клітинах підшлункової залози щура WAG, тоді як Src та Fyn не вдалося виявити (рис. 5). Для кінази Src ми використовуємо контроль (клітинний лізат клітинної лінії A431), оскільки Src описаний в ацинарних клітинах у літературі (Nozu et al. 1999). Однак кіназу Src неможливо виявити у наших щурів. IB: Так Lyn Fyn Src 1 2 3 4 5 Рис. 5: Експресія кіназ сімейства Src в ацинарних клітинах щура WAG. Доріжки 1 - 4: загальний білок; Доріжка 5: позитивний контроль для Src (клітинний лізат з А431).