Роль фосфоліпідів та окислених ліпідів у переробці амілоїдного попередника

З області експериментальної неврології, теоретичної медицини та біологічних наук медичного факультету Університету Саар-Хомбург/Саар Значення фосфоліпідів та окислених ліпідів для обробки білка-попередника амілоїду (APP) та хвороби Альцгеймера Дисертація для здобуття ступеня доктора наук Природничі науки медичного факультету УНІВЕРСИТЕТУ СААРЛАНДУ 2016 представлена ​​Віолою Й. Гоптенталь, яка народилася 24 серпня 1982 року в Саарбрюкені

ліпідів

(3.2.9) Визначення α-секретази та активності ADAM-10 після інкубації in vitro 25 (3.2.10) Визначення вмісту Aβ, sappβ та sappα. 26 (3.2.11) Визначення вмісту ADAM-17, BACE-1 та PS-1. 27 (3.3.) Аналіз ліпідів. 28 (3.3.1) Вилучення ліпідів із мозку людини після смерті. 28 (3.3.2) Вимірювання стабільності DHA. 28 (3.3.3) Визначення вмісту ліпідів за допомогою мас-спектрометрії. 28 (3.3.4) Визначення вмісту фосфоліпідів за допомогою тонкошарової хроматографії. 29 (3.3.5) Визначення вмісту HNE. 30 (3.3.6) Визначення перекисного окислення ліпідів. 30 (3.4) РНК-аналіз. 31 (3.4.1) Виділення РНК. 31 (3.4.1) синтез cdns та ланцюгова реакція полімерази в режимі реального часу (RT-PCR). 31 (3.5) Статистична оцінка. 32 (4) публікації. 33 (4.1) Короткий зміст публікації 1 та опис доплати. 33 (4.2) Короткий зміст публікації 2 та опис доплати. 69 (4.3) Короткий зміст публікації 3 та опис доплати. 87 (5) Розширене резюме. 102 (5.1) Ліпіди при AD. 102 (5.2) У контексті: Фосфоліпіди, DHA та окислені ліпіди при обробці APP та їх роль у AD. 104 (6) Резюме та прогноз. 117 (7) Участь в інших публікаціях. 119 (8) Бібліографія. 121 (C) Подяка. 133

Абревіатури (B) Абревіатури C градусів Цельсія мкм мікромолярний AA арахідонова кислота Aβ амілоїд β AD Хвороба Альцгеймера ADAM α-секретаза A-дезинтегрин-і-металлопротеаза AICD внутрішньоклітинний APP-домен Aph англ. Передня Глотка-дефектний АРО Е аполипопротеина Е АРР білка-попередника амілоїду Васі β-секретази БСА бичачий сироватковий альбумін СОХ циклооксигенази ЦФК С-кінцевий домен модифікованого Дульбекко APP DHA докозагексаєнова кислота DMEM Dublecco сек DNS дезоксирибонуклеїнової кислоти ECE ендотеліну-перетворюють ферменти ECE ендотелін-конвертує TA Хім Етиленгліколь тетраоцтова кислота EOAD Рання форма хвороби Альцгеймера EPA Ейкозапентаенова кислота FAD Сімейна форма хвороби Альцгеймера FCS Фетальна теляча сироватка г/г грам/прискорення за рахунок сили тяжіння GSK3β Глікогенсинтаза кіназа 3 год. HBSS Сольовий буферний розчин для первинних нейронів 3-H-H-GCR 3-метилглутариловий кофермент А-редуктаза 5

Абревіатури HNE 4-Hydroxynonenal HPLC високоефективна рідинна хроматографія IDE Фермент, що розщеплює інсулін IP імунопреципітація LDH лактатдегідрогеназа Вимірювання LDL ліпопротеїн з низькою щільністю навантаження Пізня форма хвороби Альцгеймера LOX ліпоксигеназа LRP1 ліпопротеїн рецептор 1 хв. 1 нейропротектин-D1 NTF нейрофібрилярні клубки OD оптична щільність P р-значення, рівень значущості PBS фосфатно-забуференний фізіологічний розчин PC фосфатидилхолін PE фосфатидилетаноламін PL плазмалог PS PS фосфатидилсерин PSEN англ. Підсилювач пресеніліну RIP регульований внутрішньомембранний протеоліз RNS рибонуклеїнова кислота RT кімнатна температура RT-PCR в реальному часі полімеразна ланцюгова реакція SAD спорадична форма хвороби Альцгеймера сапп розчинний APP s другий SDS додецилсульфат натрію PAGE поліакриламід гель електрофорез SPT серин пальмітоїл-коензим дикий тип WBABA

Вступ Після того, як α-секретазу вирізають, зв’язаний з мембраною αctf розщеплюється γ-секретазою, яка вивільняє невеликий фрагмент p3 у цитозольній AICD та позаклітинно. AICD з неамілоїдогенного шляху, на відміну від амілоїдогенного, розкладається всередині клітини за допомогою ферменту, що розщеплює інсулін (IDE), тому транскрипційна значимість цього AICD є суперечливою (Belyaev et al. 2010). Функція p3 досі незрозуміла. Огляд обробки додатків наведено на рисунку 1. Рисунок 1 Схематичне зображення обробки APP, змінене (Grimm, Rothhaar & Hartmann 2012). Неамілоїдогенна обробка, показана вище праворуч, бере на себе α- (зелена) та γ-секретаза (синя). Спочатку утворюються розчинний sappα та αctf на основі мембрани. Тоді утворюються p3 і AICD. Aβ позначений червоним у APP. Амілоїдогенна обробка показана внизу зліва. Β-секретаза розщеплює АРР, що призводить до саппβ і βctf. Потім Aβ і AICD вивільняються γ-секретазою. 16

Публікації ліпідів у клітинах та ізольованих мембранах, які проводив С. Гресген (малюнок S5), проводив інкубації ліпідів. Для визначення вмісту ПК, ПЕ і ПС за допомогою тонкошарової хроматографії, яку проводив Б. Хандсдерфер (фігура S2), та визначення ліпідного профілю, яку проводив С. Гресген (таблиця S5), я маю мембрани від SH -Клітини SY5Y та посмертний мозок людини ізольовані. Я проводив статистичний аналіз даних за допомогою ANOVA у співпраці з В. Циммером та Дж. Леманом (рис. 1-4, таблиця S1-4). Публікацію 1 можна знайти нижче. Оригінал публікації можна знайти на веб-сайті видавництва MDPI AG (Базель, Швейцарія), www.mdpi.com/journal/ijms, під номером doi: 10.3390/ijms14035879. 35

Додаток Rothhaar et al Publica ons Рис. S1 Цитотоксичність після інкубації ліпідів Рис. S2 Контроль специфічності в аналізі -секретази Рис. S3 Контроль специфічності цитотоксичності -секретази 5 4 3 2 1 [%] н.с. н.с. флуоресценція (-секретазна активність) [RFU] контроль + -інгібітор секретази флуоресценція (-секретазна активність) [RFU] контроль + -інгібітор секретази PC 22: 6 PC-PL 22: 6 PE 22: 6 PE-PL 22: 6 0 2000 4000 6000 8000 час [сек] 0 1000 2000 3000 4000 5000 час [сек] Рис. S4 Контроль специфічності флуоресценції аналізу -секретази (активність -секретази) [RFU] контроль + -інгібітор секретази 0 2000 4000 6000 час [сек] 86

Публікації На додаток до аналізу в живих клітинах, я здійснив інкубацію мембран з клітин SH-SY5Y та подальше вимірювання активності β-секретази та статистично оцінив дані (рис. 2в). Визначення експресії секретарів проводив Дж. Метт після моєї інкубації клітин з окисленими ліпідами (малюнок 2г). Т. Блюмель визначав активність β- ​​та γ-секретази після інкубації з DHA (результати в тексті), а C. Stahlmann - стабільність DHA (результати в тексті); Я проводив інкубацію з ліпідами для обох аналізів. Статистичну оцінку рівнів Аβ після інкубації з DHA та окисленими ліпідами проводив Н. Mylonas (результати в тексті). Публікацію 3 можна знайти нижче. Оригінал публікації можна знайти на веб-сайті видавництва S. Karger AG (Базель, Швейцарія), www.karger.com/ndd, під номером doi: 10.1159/000440839. 89