Склад тіла та аналіз метаболічної клітини в протоколі мишей із високим вмістом жиру (переклад на німецьку)
Резюме
Цей протокол описує використання аналізу складу тіла та системи моніторингу метаболізму тварин для характеристики складу тіла та метаболічних параметрів у мишей. Прикладом застосування цих методів є модель ожиріння, спричинена годуванням з високим вмістом жиру.
Анотація
Зміни у складі тіла (жиру чи нежирної маси), метаболічні параметри, такі як споживання кисню у всьому тілі, витрата енергії та використання субстрату, а також поведінка, така як споживання їжі та фізична активність, можуть надати важливу інформацію щодо основних механізмів захворювання. Враховуючи важливість будови тіла та обміну речовин, розвитку ожиріння та подальших наслідків, необхідно проводити точні виміри цих параметрів у доклінічних дослідженнях. Досягнення технологій за останні кілька десятиліть дозволили застосовувати ці заходи на моделях гризунів неінвазивно та поздовжньо. Як результат, ці метаболічні заходи виявилися корисними для оцінки реакції на генетичні маніпуляції (наприклад, нокаутування або трансгенні миші, вірусний нокдаун або надмірна експресія генів), експериментальний скринінг препаратів/сполук, а також дієтична, поведінкова або фізична активність Втручання. Тут ми описуємо протоколи для вимірювання складу тіла та метаболічних параметрів за допомогою системи спостереження за тваринами у мишей, що харчуються чау та з високим вмістом жиру.
Вступ
Багато аспектів нормальної клітинної, органічної та цілої фізіології організму підтримують метаболізм. Як результат, в умовах різних захворювань зміни метаболізму можуть безпосередньо сприяти основному захворюванню або бути скомпрометованими як побічний ефект патології. Традиційно метаболічні дослідження та дослідження енергетичного балансу зосереджувались на галузі ожиріння та пов'язаних з ним станах, таких як резистентність до інсуліну, переддіабет, непереносимість глюкози, серцево-судинні захворювання та діабет. Це дослідження виправдане з огляду на зростаючу поширеність таких умов у всьому світі та на індивідуальні, соціальні та економічні витрати, які спричиняють ці умови. Таким чином, розробка стратегій профілактики та нових препаратів для боротьби з ожирінням є постійною метою дослідницьких лабораторій по всьому світу, і в цих дослідженнях значною мірою покладаються на доклінічні моделі мишей.
У цьому протоколі ми пропонуємо прямий опис використання аналізу складу тіла для оцінки складу тіла у мишей та системи моніторингу метаболізму тварин для вимірювання аспектів метаболізму. Міркування та обмеження щодо цих методів обговорюються разом із запропонованими методами аналізу, інтерпретації та подання даних.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Усі описані експерименти були схвалені Альтернативним комітетом з етики тварин Альфреда з медичних досліджень (AMREP AEC), а про мишей доглядали гуманно відповідно до Національних рекомендацій Національної ради з питань охорони здоров’я та медичних досліджень (NHMRC) щодо випробувань на тваринах. Тваринам було призначено дієту та воду за умови, і вони знаходились у середовищі з контрольованою температурою (
21-22 ° C) з легким 12 год і 12 год темрявим циклом. Семитижневих мишей-самців (на тлі C57Bl/6J) або регулярно годували звичайною чау-дієтою (енергетичний вміст 14,3 МДж/кг, що складається з 76% кДж з вуглеводів, 5% жиру, 19% білка; див. Таблицю Матеріали) або для групи з високим вмістом жиру - дієта з високим вмістом жиру (HFD) () енергія 19 МДж/кг, що складається з 36% вуглеводів, 43% жиру, 21% білка, спеціальні корми кДж) протягом 3 тижнів. Склад маси тіла та зросту за допомогою апарата EchoMRI робили щотижня, тоді як моніторинг метаболічного аналізу у молюска проводився через 3 тижні дієти.
(1) Процедура аналізатора складу тіла
Примітка: Щоб оптимально функціонувати, EchoMRI 4-в-1, що використовується в цьому протоколі, повинен знаходитися в приміщенні, де температура повітря є стабільною і не коливається. В ідеалі це слід постійно контролювати. Щоб перейти до живлення машини, слід уникати перебоїв, якщо це можливо. Якщо електроживлення було перервано, і систему потрібно перезапустити, ви можете дати мінімум 2-3 години, щоб машина прогрілася, перш ніж використовувати її знову. Перш ніж почати, переконайтеся, що ви наділи належні засоби індивідуального захисту.
2. Моніторинг процедури обміну речовин у тваринах
Примітка: Система вимагає
2 год для нагрівання та стабілізації. Коли машину вимкнено, її потрібно ввімкнути, щоб клітину оксиду цирконію можна було нагріти до 725 ° C. Також ми зазвичай поміщаємо мишей в аналізатор складу тіла за день до входу в тварину, систему моніторингу, проблеми з Небажання уникати стресів.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Результати на малюнку 3 можна бачити, що вказує на типову зміну параметрів складу тіла при годуванні з високим вмістом жиру, виміряне за допомогою EchoMRI. На початку не було різниці в будь-якому виміряному параметрі (рис. 3А-Ф.). Однак лише через 1 тиждень годування з високим вмістом жиру спостерігалося значне збільшення маси тіла, маси жиру та масового відсотка жиру в групі HFD (рис. 3А,B.,Д.). Ступінь відмінностей між двома групами щодо цих заходів продовжувала зростати протягом 3-тижневого дієтичного втручання. М'язова маса, вільна вода та загальний вміст води (рис.3,E.,Ф.) не розрізняти групи в будь-який момент часу. Також можна помітити, що миші чау продовжували набирати вагу протягом досліджуваного періоду (рис. 3А), що годували, це було збільшення нежирної маси (рис.3) замість збільшення жирової маси (рис. 3 b).
RER був значно нижчим у мишей з високим вмістом жиру, що вказує на використання жиру порівняно з використанням вуглеводів при дієті з високим вмістом жиру (рис. 5А) нагодований. Споживання енергії (тепло) без нормалізації стало важчим для тварин, можливо, через те, що тварини мають більш метаболічно активну тканину (рис. 5b), причому ця різниця втрачається після нормалізації до маси тіла (рис.5) підвищений. Також зверніть увагу на збільшення VO2, RER та витрат енергії в темному циклі порівняно із світловим циклом, коли миші активніші. Ці відмінності представляють класичні щоденні зміни обміну речовин, що відбуваються у мишей. Хоча в цьому прикладі ми розділили дані на 12-годинні блоки, також може бути корисним розподіл даних на менші часові епохи. Фізична активність також є фактором, який сприяє витраті енергії. Вони не відрізнялися між групами, що свідчить про те, що зниження фізичних навантажень не було рушієм фенотипу ожиріння у мишей з високим вмістом жиру (рис.5).).
статистика
Усі дані в цьому документі представлені як середнє значення ± стандартна помилка середнього значення (SEM). Статистичне значення продовжувалось на p Рисунок 1 : Правильне розміщення вартості мишей та власників зразків дрібних тварин з мишами в межах аналізу складу тіла. Виконайте системне випробування зі стандартним калібруванням (вартість) або для сканування мишей у тримачі зразків для дрібних тварин, кожен у козловій системі. Червоні стрілки показують циліндр, в якому миші будуть міститися в залі гіпостилю машини.
Малюнок 2 : Збірка окремих камер. (A) розмістіть контейнер для їжі в середині шкали. Б) розмістіть майданчик у кожній камері та розмістіть камеру над лійкою. В) Миші в камерах індивідуально і накривають. D) розташуйте і закріпіть пляшку з водою.
Малюнок 3 : Аналіз складу тіла протягом 3 тижнів дієти з високим вмістом жиру. (A) вага тіла, (B) Жирова маса, (C) відкинути натовп, (D) Масова частка жиру, (E) Вміст води, безкоштовно і (F) Загальний вміст води. Кола представляють звичайні дієти чау, квадрати - HFD. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.
Малюнок 4 : Метаболічні параметри, отримані з метаболічної системи моніторингу тварин через 3 тижні відповідної дієти. Мишей утримували в камерах протягом 48 год з першими 24 год в якості індукції. Дані за другу 24 год були проаналізовані та представлені у цих числах. (A) Сирі ціни на VO2, Б) VO2 нормалізується до маси тіла (C) VO2 нормалізується до м’язової маси, (D) Діаграма розсіювання для некорегованого VO2 (загальний 24-годинний період) ваги тіла, т та (E) невідрегульована нежирна маса тіла VO2. A-C Білі смужки являють собою звичайну дієту чау, чорні смужки - дієту з високим вмістом жиру. Д-Е Кола представляють звичайні дієти чау, квадрати - HFD. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.
Малюнок 5 : A) Коефіцієнт дихального обміну (RER), (B) Тепло (енергоспоживання) і (C) Тепло нормалізується до маси тіла. D) Рівень активності, розрахований як сума амбулаторного пучка X та Y, розривів та розривів Z променя. Білі смужки являють собою звичайну дієту чау; чорні смуги представляють HFD.
Малюнок 6 : Дані про вживання їжі в систему за останні 24 години. (A) Споживання їжі в грамах, (B) Прийом їжі нормалізується до маси тіла і (C) розраховане споживання енергії. n = 4-5 (3 миші були виключені через велику кашу з їжею). Білі смужки являють собою звичайну дієту чау; чорні смуги представляють HFD. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Важливі кроки
Описані тут протоколи дають приклад того, як вимірювати склад тіла та різні метаболічні параметри у мишей за допомогою аналізу складу тіла та системи моніторингу метаболізму тварин. Для обох методів життєво важливо забезпечити оптимальну роботу машин, і для цього надзвичайно важливо, щоб дослідник провів тест фізичного складу для аналізу тіла та відкалібрований за відомим газовим складом для метаболічної системи моніторингу тварин. обладнання. Це дає більшу узгодженість результатів та можливість виявлення потенційних проблем з машиною.
Модифікації та виправлення помилок
обмеження
Майбутні додатки
Хоча в цій публікації ми використовували ожиріння, набуте під час годування з високим вмістом жиру, як приклад захворювання, коли корисним є вимірювання складу тіла та метаболічних параметрів, використання цих пристроїв далеко не обмежується цією областю досліджень. Використання цих методів також є цінним при вивченні таких захворювань, як діабет, серцево-судинні захворювання, вікова саркопенія, слабкість, кахексія раку, м'язова дистрофія та ліподистрофія. Хоча початкові витрати на придбання такої інфраструктури є значними, можливість використання пристрою в різних та різних сферах медичних досліджень пом'якшує цю початкову вартість. Крім того, постійні витрати на реактиви та витратні матеріали для цих машин мінімальні; Однак профілактичне обслуговування та обслуговування повинні бути враховані та передбачені бюджетом.
Методи, описані в цій роботі, можуть бути використані для характеристики складу тіла та різних метаболічних параметрів у мишей. Ці заходи застосовуються до великої кількості дослідницьких областей і надають важливу інформацію для характеристики фенотипу. Дані цих методів також можуть вказувати на основні механізми, що обумовлюють певний метаболічний фенотип. Подальший розвиток та вдосконалення цих технологій дозволяє дослідникам просувати свої результати до терапевтичних результатів.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.