Стефані Роберт Кандидатська дисертація з біології рослин - PDF Безкоштовно завантажити
Спрямована диверсія клітинного метаболізму в дикому тютюні Nicotiana benthamiana, яка використовується як господар для гетерологічної експресії білків, що представляють клінічний інтерес.
Нарешті, останнє, але не менш важливе: дякую моєму чоловікові Стефану за його підтримку та любов, незважаючи на всі ці вечори, ночі та вихідні працювати, іноді зневірятися, але ніколи не поступатися. Стефанія х
Стефану та Захарі, xi
Зміст Резюме. iii Анотація. v Передмова. vii Подяки. ix Зміст. xiii Список таблиць. xvii Список рисунків. xix Список скорочень. xxi Загальне вступ. 1 Глава 1. 3 Огляд літератури. 3 1.1 Виробництво рекомбінантних білків. 5 1.1.1 Звичайні виробничі системи. 5 1.1.1.1. Бактерії. 5 1.1.1.2 Дріжджі. 6 1.1.1.3 Клітини тварин. 6 1.1.1.4 Яйця. 7 1.1.2 Рослинна молекулярна культура: ефективна альтернатива для виробництва рекомбінантних білків. 7 1.1.2.1 Трансфекція рослинних клітин. 8 1.1.2.2. Стабільне перетворення, перехідний вираз. 9 1.2 Протеоліз, часто перешкода для отримання задовільних урожаїв у молекулярному рослинництві рослин. 11 1.2.1 Нестабільність рекомбінантних білків у плантатах. 11 1.2.2 Старіння та протеоліз. 12 1.3 Стратегії захисту рекомбінантних білків у молекулярному рослинництві рослин. 13 1.3.1 Стабілізація рекомбінантних білків ex planta. 13 1.3.2 Стабілізація рекомбінантних білків у плантатах. 14 xiii
4.5.8 Аналізи протеази. 74 4.5.9 Кількісне визначення С5-1. 75 4.5.10 Статистичний аналіз. 75 4.6 Результати та обговорення. 75 4.6.1 MeJA індукує ребалансування протеомів листків у N. benthamiana. 4.6.2 MeJA має незначний вплив на взаємодію N. benthamiana A. tumefaciens. 79 4.6.3 MeJA також мало впливає на активність протеаз у трансфікованих листках. 80 4.6.4 Лікування MeJA збільшує накопичення тимчасово експресованого рекомбінантного білка 83. 84 4.7 Висновки. 85 4.8 Подяки. 86 4.9 Довідкова інформація. 86 Розділ 5. 95 Висновки та перспективи. 95 5.1. Повернемось до гіпотез. 97 5.1.1 Основна гіпотеза 1 про вплив стадії розвитку листя на врожайність антитіла С5-1. 98 5.1.2 Основна гіпотеза 2 про вплив захисних шляхів рослини-господаря на вихід антитіл C5-1. 99 5.2. На закінчення. 101 Список літератури. 103 Додаток. 125 Розділ книги. 125 xvi
Список таблиць Розділ 3 Таблиця 3.1 Врожайність C5-1 (мкг) на лист і на рослину в рослинах N. benthamiana, що тимчасово експресують окремий C5-1 або C5-1 з SlCys8 або SlCDI. 48 Таблиця S3.1 Протеолітична активність (одиниць/сек) у цілих листках та апопластичних екстрактах листя N. benthamiana через шість днів після інфільтрації агробактеріями, що містять порожній вектор, або агробактеріями, що містять вектор експресії С5-1 або нефільтруються. 57 Розділ 4 Таблиця 4.1 Білки, пов’язані зі стресом, які регулюються у листі N. benthamiana через 7 днів після лікування. 78 Таблиця S4.1 Доповнення до таблиці 1: Відповідні унікальні пептиди для регульованих стресом білків, регульованих в N. benthamiana, залишають 7 днів після обробки. 88 Таблиця S4.2 Прямий та зворотний олігонуклеотидні праймери, що використовуються для аналізів ПЛР у реальному часі. 93 xvii
Перелік рисунків Розділ 1 Рисунок 1.1 Схематичне зображення плазміди Ti (A), типового бінарного вектора (B) та плазміди "помічник" (C), яка використовується для трансформації. Взято з Pacurar et al., 2011. 10 Рисунок 1.2 Стабілізація легких та важких ланцюгів рекомбінантного антитіла C5-1 в агроінфільтрованих листках Nicotianana benthamiana, що тимчасово експресують SlCDI або SlCYS9. 18 Рисунок 1.3 Взаємозв'язок між метаболічними шляхами, залученими до системної резистентності, індукованої у рослин, шляхами, залежними від саліцилової кислоти (SA), та шляхами, залежними від язмонової кислоти (JA). 21 Розділ 3 Рисунок 3.1 Бінарні вектори для вираження C5-1, SlCYS8 та SlCDI. 40 Рисунок 3.2 Характеристика біомаси листя N. benthamiana 44 Рисунок 3.3 Основні протеолітичні дії в листі N. benthamiana 46 Рисунок 3.4 Вплив коекспресованого SlCYS8 або SlCDI на накопичення C5-1. 49 Рисунок 3.5 Біологічна активність C5-1, виражена окремо або разом із SlCYS8 або SlCDI . 51 Рисунок 3.6 Кумуляція біологічно активної C5-1, вираженої поодинці або разом із SlCYS8, за часом. 53 Рисунок S3.1 Рівні активності C5-1 уздовж градієнта віку листя. 58 xix
Список скорочень AACT ADN; КДНК ДНК; кДНК Т-ДНК; Т-ДНК ADP ANOVA РНК; МРНК РНК; mrna BTH CaMV CHO ELISA EV Fab HC HCl Ig JA LC MeJA MES NaCl no WHO PBS PCR PDI PR RuBisCO RE; ER RSA α 1 -антихімотрипсин людської дезоксирибонуклеїнової кислоти; комплементарна ДНК дезоксирибонуклеїнової кислоти; комплементарна ДНК-передача ДНК; перенесення ДНК Аденозин дифосфат Дисперсійний аналіз; дисперсійний аналіз рибонуклеїнової кислоти; РНК-індуктор рибонуклеїнової кислоти; месенджер РНК Бензотіадіазол Цвітна капуста Мозаїка Вірус Клітини яєчника китайського хом'ячка Ензимно-зв’язаний імуносорбент Аналітична інфільтрація з порожнім вектором Фрагмент антигензв’язуючого Важка ланцюг (важкий ланцюг) Хлорид водню (хлорид водню) Імуноглобулін Язмонова кислота (жасмонова кислота) Легкий ланцюг (легкий ланцюг) ) Метил-ясмонат (Метил-ясмонат) 2- [N-морфоліно] етансульфонова кислота Хлорид натрію (хлорид натрію) Нопалін-синтаза Всесвітня організація охорони здоров'я Фосфатно-сольовий сольовий розчин Полімеразна ланцюгова реакція (полімеразна ланцюгова реакція) Білок дисульфід-ізомераза Патогенез (білок) Рибулоза- 1,5-біспосфатна карбоксилаза/оксигеназа Ендоплазматичний ретикулум; ендоплазматичний ретикулум Набутий системний опір xxi
RIS Індукований системний опір SA Саліцилова кислота (саліцилова кислота) ScFv Одноланцюговий змінний фрагмент SD Стандартне відхилення SDS-PAGE Натрію додецилсульфат-поліакриламідний гель Електрофорез SE Стандартна помилка (стандартна помилка) SlCDI Інгібітор катепсину D томатів; Інгібітор катепсину D Solanum lycopersicum SlCYS8 Восьма субодиниця мультицистатину помідора; Solanum lycopersicum мультицистатин восьма субодиниця SlCYS9 Томат цистатин no. 9; Solanum lycopersicum Cystatin 9 SP Сигнальний пептид (сигнальний пептид) TEV Вірус травлення тютюну TMB 3,3,5,5 -тетраметилбензидин xxii
Глава 1 Огляд літератури 3
складно, як правило, вважають, що t-ланцюг зібраний в клітині рослини і оточений білками VirD2 і VirE2, які мають сигнали локалізації ядер і діють як пілотні білки для міграції Т-ДНК до клітинного ядра (Lacroix et al ., 2006; Pacurar та ін., 2011). 1.1.2.2 Стабільна трансформація, транзиторна експресія Для експресії рекомбінантних білків у рослинах із використанням A. tumefaciens використовуються два підходи: стабільна трансформація та транзиторна експресія після трансфекції. Стабільна трансформація включає виробництво трансгенних рослинних ліній, усі клітини яких несуть інтегрований трансген. На практиці розробка та вибір трансгенної лінії, корисної в молекулярній культурі, може зайняти кілька місяців, а то й більше року. Крім того, отримання високого врожаю часто неможливе, а іноді і нестабільне, через випадковий характер місця вставки гена та явища "затихання генів" (або репресії генів), встановлені в рослині з часом, які спричиняють деградацію РНК-повідомлення, кодовані трансгеном (Rybicki, 2008). 9
17 кДа, кодовані ядерним геномом і великою субодиницею
Розділ 2 Гіпотези та цілі дослідження 25
Попереднє дослідження, проведене в нашій лабораторії, продемонструвало значний вплив дози MeJA 400 мкм на ідентичність білків у листі картоплі (Rivard et al., 2004). У цьому дослідженні ми протестували зростаючі дози MeJA, що варіюються від 0 до 2000 мкм, щоб оцінити, чи передбачувана реакція рослини на шкалі протеомів залежить від дози. Ми також оцінили вплив різних доз MeJA на накопичення антитіла C5-1 та рівень транскрипції його важких та легких ланцюгів у зрілому дорослому листі. 32
Глава 3 Захист рекомбінантних антитіл ссавців від залежного від розвитку протеолізу в листі Nicotiana benthamiana Результати цієї глави були опубліковані в 2013 році в науковому журналі PLoS One 1. Авторами статті були Стефані Роберт, Мустафа Хальф, Марі-Клер Гулет, Марк -Андре Д Ауст, Френк Сенсбері та Домінік Мішо. 1 Robert S, Khalf M, Goulet M-C, D'Aoust M-A, Sainsbury F, Michaud D (2013) Захист рекомбінантних антитіл ссавців від залежного від розвитку протеолізу в листі Nicotiana benthamiana. PLOS One 8 (7), e70203. 33
3 мг антитіла на рослину. Позитивного ефекту SlCYS8 не спостерігали у старих листків, у яких рівень активності протеази C1A підвищувався при дуже низькій експресії інгібітора. На противагу цьому, врожайність C5-1 була збільшена ще на 40% у молодих листках після більш тривалого інкубаційного періоду, від восьми до десяти днів, що корелювало з продовженням експресії інгібітора SlCYS8 протягом цього періоду. Ці дані підтверджують, що спільна експресія інгібіторів протеази проти протеаз C1A є перспективною стратегією збільшення врожаю рекомбінантного білка в рослинах. Однак вони вказують на доцільність додаткових досліджень для вдосконалення цього підходу з урахуванням впливу фізіологічного віку листя та присутності протеаз з альтернативних функціональних класів. 36
3.3 Анотація Експресія клінічно корисних білків у рослинах була підсилена розвитком високопродуктивних систем для транзиторної експресії білка за допомогою агроінфільтрації. Зараз потрібно знати більше про те, як розвиток рослини-господаря та обмін речовин впливають на кількість та якість рекомбінантних білків. Ендогенний протеоліз є ключовим фактором, що визначає стабільність і вихід рекомбінантних білків у рослинах. Тут ми охарактеризували профілі цистеїну (C1A) та аспартату (A1) у листках широко використовуваного експресійного господаря Nicotiana benthamiana, у зв'язку з продукуванням мишачого IgG, C5-1, спрямованого на секреторний шлях клітини. Агроінфільтрація суттєво змінила розподіл протеаз С1А та А1 уздовж градієнта віку листя, з кореляцією між віком листя та рівнем протеолізу в цільноклітинних екстрактах та екстрактах апопластів. Спільна експресія цистатину томата SlCYS8, інгібітора протеаз C1A, поряд із C5-1 збільшувала вихід антитіл майже на 40% після звичайного 6-денного інкубаційного періоду, до
3 мг на рослину. Ніякого позитивного ефекту SlCYS8 не спостерігали у найстаріших листків, відповідно до підвищеного рівня активності протеази C1A та дуже низької швидкості експресії інгібітора. Навпаки, вихід C5-1 був більшим на додаткові 40% після 8-10-денних інкубацій у молодих листках, де зберігалася висока експресія SlCYS8. Ці висновки підтверджують, що спільна експресія інгібіторів рекомбінантних протеаз є перспективною стратегією збільшення врожаю рекомбінантних білків у рослинах, але існує подальша можливість вдосконалити цей підхід, враховуючи вплив віку листя та протеаз інших класів. 37
6. Міні-трансферний пристрій Bio-Rad для електротрансферу білків на листи нітроцелюлози (Bio-Rad). 7. Листи нітроцелюлози Hybond C (GE Healthcare, Baie d Urfé QC, Канада). 8. Стандартні реагенти для електрофорезу додецилсульфату натрію та поліакриламідного гелю (SDS-PAGE) та імуноблотингу (див. Посилання 33 та 34). 9. Оцифровщик Microtek ScanMaker II (лабораторія Microtek, Торранс, Каліфорнія, США). 10. Програмне забезпечення 2-D Expression Phoretix, v. 2005 р. Для аналізу гелевих зображень (NonLinear USA, Durham NC, USA). 11. Інкубатор для струшування з контролем температури. 12. Відцентровий холодильник. 13. Основний спектрофотометр. 14. Камера добового росту рослини. 15. Круговий діркопробивач (
1-см 2). 16. Алюмінієва фольга. 17. Полівініл-поліпіролідон. 18. Бредфордський набір для аналізу білка (Bio-Rad). 2.5. Буфери та інші розчини Буфери та інокуляти виготовляються у вигляді водних розчинів. Робочі буфери та покрокові протоколи для широко використовуваних методів SDS-PAGE та імуноблотингу описані в посиланнях. 33 та 34 відповідно. Для імунодетекції постачальники, як правило, пропонують прості процедури, що включають мічені лужною фосфатазою або пероксидазою вторинні антитіла та відповідні реагенти для виявлення смуги білка. 1. Інокуляція бактерій: запаси гліцерину клітин Agrobacterium, вирощені в рідкому середовищі LB, що містить 50 мкг/мл канаміцину та 100 мкг/мл карбеніциліну. 2. Буфер для інфільтрації листя: 10 мМ MES-KOH (2- [N-морфоліно] етансульфонова кислота), ph 5,6, що містить 10 мМ MgCl 2 та 100 мкм ацетосирингону. Готуйте свіжі. 3. Буфер для екстракції листя: 50 мМ трис-HCl, ph 7,5, що містить 150 мМ NaCl та повний коктейль інгібітора протеази (1 таблетка на 10 мл екстракційного буфера) (Roche, Laval QC, Канада, продукт No 04693116001). Готуйте свіжі. 130
3 Методи 3.1. Коекспресовані інгібітори супутника Тут описана процедура оцінки ефективності інгібітора-супутника у захисті протеазочутливих рекомбінантних білків, тимчасово експресованих у листках N. benthamiana (див. Примітку 4). Коротше кажучи, процедура складається з: (i) інфільтрації листя N. benthamiana агробактеріальними суспензіями, що містять відповідні вектори, що кодують трансген; (ii) відновлення білків листя після 6-денної фази інкубації в камері росту для гетерологічної експресії білка; та (iii) оцінка впливу експресії супутнього інгібітора на накопичення та цілісність рекомбінантного білка. Легкі та важкі ланцюги антитіла C5-1, експресовані окремо або в поєднанні з цистатином томату SlCYS8, беруться як приклад для демонстрації (рис. 1). 3.1.1. Рост бактерій та агроінфільтрація листя 1. Вирощують посів бактерії до стабільної фази при перемішуванні при 28 С у середовищі LB, що містить 50 мкг/мл канаміцину та 100 мкг/мл карбеніциліну. 2. Центрифугуйте культури для вирощування при кімнатній температурі протягом 5 хв при 2000 g і ресуспендуйте бактеріальні гранули в буфері для інфільтрації листя до OD 600
0,4. 3. Змішайте рівні обсяги бактеріальних суспензій, що містять вектори експресії для С5-1, пригнічувач звуку р19 та супутній інгібітор SlCYS8, і дайте постояти протягом 2 годин при кімнатній температурі перед інфільтрацією. Контрольний посівний препарат готують паралельно шляхом змішування бактерій для C5-1 та білка p19 з бактеріями, що несуть реципієнтний (порожній) вектор, що використовується для конструювання конструкції SlCYS8. 131
3.1.2. Перехідна експресія та відновлення білка 1. Інкубуйте інфільтровані рослини протягом шести днів при 20 C у камері росту протягом 16 годин: 8 годин світло/темний фотоперіод, щоб забезпечити трансфекцію клітин та перехідну експресію білка (див. Примітку 6). 2. Зберіть три