TD Біохімія n; 4, електрофор; se, Exp 1

Експеримент 1: Побудова геномного банку ДНК для Candida albicans.

Мета експерименту:

електрофор

Для того, щоб створити бібліотеку мутацій вставки (маркера), спочатку потрібно створити бібліотеку геномної ДНК. Бібліотека вставки буде використана для пошуку генів, що беруть участь у формуванні біоплівки у Candida albicans. Цей умовно-патогенний грибок часто зустрічається у імунодепресивних пацієнтів (наприклад, СНІД), де він вражає слизові оболонки та викликає кандидоз (фото). Однак колонізація поверхонь (і формування біоплівки), наприклад, судинних катетерів, також є важливою проблемою в медицині (внутрішньолікарняні інфекції), оскільки може спричинити "розповсюджений" кандидоз (що може призвести до серйозних уражень потенційно всі внутрішні органи).

Передмова: Інструкції:

  • Потрібні зміни? Це тут: Вступ
  • На проведення експерименту у вас є 25 хвилин. Не витрачайте занадто багато часу.
  • Уважно прочитайте опис досвіду. Коли вас попросять зробити вибір, подумайте над цим і натисніть на відповідь, яка має для вас найбільший сенс.
  • Навіть якщо ви відповіли правильно, не забудьте прочитати інші варіанти.
  • Відповіді на запитання в курсивом зазвичай з’являються на іншій html-сторінці (клацніть на питання). Не зупиняйтеся на цих питаннях.
  • Питання червоного кольору будуть обговорюватися під час узагальнення досвіду.
  • Якщо ви не завершите експеримент протягом відведеного часу, ви можете повторити це пізніше. Веб-адреса досвіду зв’язана на Dokeos.
  • Ви завжди можете надіслати мені свої коментарі електронною поштою: [email protected].

Цей віртуальний досвід натхненний реальним досвідом, однак, щоб зробити підручник цікавішим та заохотити до запитань, були зроблені адаптації (деякі з яких малоймовірні).

Вступ:

Конвенція: 1Mb = 1'000 kb = 1'000'000 bp. Це спосіб кількісного визначення розміру молекул ДНК в парних нуклеотидах. Кожна амінокислота (аа) кодується (на ДНК/РНК) групою з 3 нуклеотидів (= кодон). Вимірювання ORF (= відкрита рамка зчитування; частина гена, що кодує білок)

Тому 1 кб кодує білок

Candida albicans - це диплоїдний, одноклітинний (нижній еукаріотичний) гриб, що росте як одна клітина та гіфи (нитки сполучених клітин). Біоплівка, утворена C. albicans, складається з одноклітинних, псевдогіфальних або навіть гіфальних клітин та позаклітинного матриксу, що складається з полісахаридів та білків. Ця біоплівка захищає C. albicans, зокрема, від протигрибкових препаратів. Формування біоплівки відбувається у три стадії: одноклітинні колонії - перша форма; тоді клітини приймають псевдогіфальну конформацію і виробляють позаклітинний матрикс. Згодом матрикс і нитки (гіфи) зростаються.

Його геном становить 16 Мб (гаплоїд) для

6500 генів (з них приблизно 200 містять інтрони; середній розмір ORF:

1,5 кб; посилання), розподілених у 8 парах гомологічних хромосом; вона була повністю послідовно розподілена в 1998 році (посилання; посилання). Генетичний аналіз Candida albicans важкий, оскільки цей гриб росте у безстатевій диплоїдній формі (Чому це проблема?).

Геномна бібліотека - це колекція плазмід, кожна з яких містить фрагмент хромосоми від організму, який ви хочете вивчити. Ідеальна геномна бібліотека в 10 разів перевищує весь геном із “перекриваючими” фрагментами різної довжини. Геномний банк може служити опорою для секвенування геному цього організму, як банк комплементації для ідентифікації рецесивних мутантів (наприклад, в експерименті TD2) або для створення інсерційного банку (інактивація гена шляхом вставки маркер).

Існує кілька способів створити банк вставки, але це не є предметом цього підручника, ми побачимо лише той, який використаний у цитованих статтях (і на якому заснований цей невеликий експеримент). З геномної бібліотеки вставки транспозоном (який включає маркер відбору) проводяться in vitro в хромосомних фрагментах бібліотеки. Після ампліфікації бібліотеки (бактеріями) фрагменти будуть вирізані з векторів і використані для трансформації клітин Candida albicans (створення колекції мутантних клітин шляхом вставки; шляхом рекомбінації вставки замінять хромосомні копії). Потім кожен трансформант буде вивчений з метою виявлення бажаного фенотипу. Потім місце вставки буде ідентифіковано шляхом секвенування.

Клацніть тут, щоб відобразити схему експерименту.

Перший крок: Підготовка вектора.

На цьому кроці ви виберете вектор та фермент рестрикції для розрізання вашого вектора (який отримає фрагменти хромосом від Candida albicans).

Для побудови вашого банку вам доступні два вектори: (натисніть на правильне зображення)

pBA01 (вигадана назва), плазміда (похідна від pUC19) з реплікацією бактеріального походження "з високою копією" (у бактерії буде від 75 до> 200 копій вектора залежно від температури), стійкість гена до бактерій до антибіотика та сайту клонування (що містить кілька сайтів рестрикції), введеного в ORF гена-репортера lacZ .

pEU01 (вигадана назва), плазміда з реплікацією бактеріального походження "з низькою копією" (у бактерії буде від 5 до 10 копій вектора), бактеріальний ген стійкості до антибіотика, але також еукаріотичного походження реплікації (від S. cerevisiae, але який також функціонує у C. albicans) та сайт клонування (що містить кілька сайтів рестрикції), введений в ORF гена-репортера lacZ .

Використовуючи інформацію про побудову банку вставки у вступній частині та наступні запитання, виберіть вектор, який ви будете використовувати для побудови свого геномного банку.

Задайте собі питання: чи збираєтесь ви перетворити свій вектор на бактерії І/АБО Candida albicans. Вам потрібне гарне посилення бактеріями вашого вектора (висока копія) чи ні (низька копія) .