Теза. Представлений для отримання диплому з біології на біологічному факультеті Рурського університету в Бохумі

Дипломна робота, подана для отримання диплом з біології на біологічному факультеті Рурського університету в Бохумі Аналіз витяжних та невилучуваних залишків сульфадіазину та його метаболітів через три роки після застосування свинячого гною до лізиметрів та ремобілізації невилучуваних залишків через активність ризосфери кукурудзи Підготовлено Вібке Шульте-Хунсбеком з фізичної географії/ґрунтознавства/ґрунтової екології факультету геологічних наук Бохума у вересні. 2009 Доповідач: проф. Бернд Маршнер Співреферент: Проф. Домінік Бегеров

Дипломна робота була створена у дружній співпраці з Forschungszentrum Jülich GmbH, членом Асоціації німецьких дослідницьких центрів імені Гельмгольца. Інститут Агросфера ICG 4 Forschungszentrum Jülich GmbH 52425 Jülich (корпус 16.6) Керівник інституту: проф. Гаррі Верекен, контактний особа на місці: доктор Йоост Грьоневег

Декларація Цим заявляю, що я написав дисертацію, подану сьогодні самостійно, і що я не використовував жодних інших джерел та посібників, крім поданих, і що я чітко вказав цитати. Ця дипломна робота складається з чотирьох копій, які повністю ідентичні словом та зображенням. Я також заявляю, що цифрові зображення містять лише вихідні дані, і що жодна обробка зображень не проводилась для зміни вмісту. Науковим керівником дисертації був: проф. Бернд Маршнер В якості співреферентів я пропоную: проф. Домінік Бегеров Бохум, (підпис)

Зміст Зміст Список малюнків Список таблиць Список скорочень та символів 1! Вступ. 13! 1.1! Сульфадіазин. 15! 1.2! Огляд літератури. 16! 1.2.1! Транспортування речовин у землі. 16! 1.2.2! Сорбція в грунті. 19! 1.2.3! Невидалювані залишки. 24! 1.2.4! Транспортне поглинання СДЗ на заводі. 25! 1.2.5! Розпад SDZ в грунті. 26! 1.2.6! Деградація SDZ фотохімічно. 27! 1.2.7! Деградація SDZ у ссавців. 28! 1,3! Постановка цілей. 30 2! Матеріал і методи. 31! 2.1! Опис випробувальних підлог. 31! 2.2! Лізиметр. 33! 2.2.1! Перевірте лізиметр. 35! 2.2.2! Історія та початковий стан тестових лізиметрів. 36! 2.3! Характеристика досліджуваної речовини. 37! 2.4! Методи. 38! 2.4.1! Відбір проб ґрунту. 38! 2.4.2! Підготовка зразків ґрунту. 39! 2,5! Супровідні параметри. 40! 2.5.1! визначення значення ph. 40! 2.5.2! Визначення вологості ґрунту. 40! 2.6! Добування ґрунту. 41 ! 6-й!

Зміст 2.7! Екстракція твердої фази. 43! 2,8! Випробування рослин. 45! 2.8.1! Експериментальне встановлення. 45! 2.8.2! Відбір проб. 47! 2,9! Аналітичні методи. 48! 2.9.1! Окислювач. 48! 2.9.2! Вимірювання LSC. 50! 2.9.3! LC-MS/MS. 51! 2.10! Оцінка. 54 3! Результати. 56! 3.1! Лізиметрові експерименти. 56! 3.1.1! 0,5 м! -Тести на лізиметр. 56! 3.1.2! 1 м! -Лизиметр. 68! 3.2! Випробування рослин. 74 4! Обговорення. 83! 4.1! Лізиметр. 83! 4.1.1! Супровідні параметри. 83! 4.1.2! Збалансування СДЗ в лізиметрах. 85! 4.1.3! Послідовна екстракція та аналіз метаболітів. 90! 4.1.4! Сорбція СДЗ. 94! 4.2! Випробування рослин. 97! 4.2.1! Супровідні параметри. 97! 4.2.2! Ремобілізація секвестрованого SDZ за допомогою ризосферної активності. 98! 4,3! Резюме. 100 5! Бібліографія. 101! 6! Додаток А. 106 ! 7-й!

Зміст Таблиця 20: Еквівалентна концентрація (в екв.) SDZ [ммоль г -1] послідовного вилучення із зразків ґрунту за допомогою тесту на лізиметр та тесту на посадку A2 (Kal) та B2 (Mer). 81! Таблиця 21: Концентрація SDZ та його метаболітів [ммоль г -1] ацето. + H 2 O екстракція у зразках грунту з експерименту з лізиметром та посадки експерименту A2 (Kal) та B2 (Mer). 82! Таблиця 22: Еквівалентна кількість (А екв.) SDZ [ммоль] послідовного вилучення із зразків ґрунту лізиметром А1 (Kal) до глибини 30 см у день відбору проб 29, 120, 218, 1022. 106! Таблиця 23: Еквівалентна кількість (А екв.) SDZ [ммоль] послідовного вилучення із зразків ґрунту лізиметром B1 (Mer) до глибини 30 см у день відбору проб 29, 120, 218, 1022. 107 ! 11!

Зміст Перелік скорочень та символів Абревіатура 4-OH-SDZ 4-гідроксисульфадіазин активність ПНГ на грам ґрунту [Бк г -1] Еквівалентна кількість [ммоль] Ацето. Acety-SDZ BBA c eq Ацетонітрил N-ацетил-сульфадіазин Настанови щодо випробування засобів захисту рослин та еквівалентної концентрації обладнання для захисту рослин [ммоль g-1] ДНК-дезоксирибонуклеїнова кислота FZJ Forschungszentrum Jülich GLP Хороша лабораторна практика Інститут високоефективної рідини Кальденс Агро Агрохімічна лабораторія Кальденс Агро Агрохіміка K/B Судини Кіка/Браукмана k OC LC-MS/MS LSC Mer MRSA MS NER PKs Коефіцієнт сорбції (n = сприятливий для органічного вуглецю) рідинна хроматографія у поєднанні з тандемною мас-спектрометрією Рідкий сцинтиляційний лічильник Мерценгаузен штами золотистого стафілокока Масовий спектрометр Невидобувні залишки від’ємний декадний логарифм кислотної константи K s! Щільність [г см - "] SDZ Сульфадіазин SOP Стандартна інструкція з експлуатації SPE Екстракція твердофазною речовиною ВООЗ Всесвітня організація охорони здоров'я Wk макс. Максимальна ємність утримання води [%]!

Вступ SDZ Транспорт у ґрунті Дослідження транспортування SDZ показали, що різні результати призводять до внесення SDZ у воду або в рідкий гній. Якщо SDZ вносити разом з рідким гноєм, дослідження Burkhardt et al. (2005), Kay et al. (2005) та Блеквелл та ін. (2007), що суспензія сприяє поверхневому стоку SDZ. Дослідження показали, що рідкий гній завдяки своєму твердому вмісту закриває дрібні пори ґрунту, а отже SDZ стікає швидше, ніж інші антибіотики (Burkhardt et al., 2005). Тип ґрунту тут не має значення; швидкий поверхневий стік спостерігався як на глинистих ґрунтах (Blackwell et al., 2007), так і на піщаних ґрунтах (Kay et al., 2005). Коли SDZ вноситься з рідким гноєм, SDZ надходить у ґрунт через пільговий потік, серед іншого, як показали дослідження Burkhardt (2007). 18-го!

Швидше, ініціюйте його концентрацію. Чим вища частка іона в ґрунтовому розчині, тим вища його частка в іонному покритті (Schroeder and Blum, 1992). Внутрішньо-сферичний комплекс SDZ заснований на утворенні складних сполук і забезпечує специфічну сорбцію. Молекула або іон ґрунтового розчину діє як ліганд і витісняє ліганд, координований навколо центрального атома іона металу. Завдяки утворенню ковалентних зв'язків між лігандами, ці внутрішньо-сферичні комплекси є дуже стабільними (Scheffer and Schachtschabel, 2002). Рис. 3: Сорбція катіонів на оксидній або глинистій мінеральній поверхні зі змінним зарядом (Sigg & Stumm 1994 Aquati Chemistry, Teubner, Stuttgart). 21-го!

Введення вуглекислого газу слід виключити. Тільки частка 2% від загальної суми, яка дається, була оцінена як 14 CO 2. Це показує, що SDZ можна дуже повільно розщеплювати в грунті. В ході поточних розслідувань можна було заявити про продукти розкладання, таким чином було виявлено 4-OH-SDZ, формил-SDZ та 4- (2-мінопіримідиніл-1 (2H)) анілін (серед іншого: Sukul et al., 2008). 1.2.6 Фотохімічна деградація SDZ Деградація SDZ сонячним світлом (УФ-випромінювання) є суто абіотичним механізмом деградації. Фотолітична деградація була, зокрема, Сукулом та співавт. (2008) та Wollters and Steffens (2005). Якщо SDZ застосовувати з суспензією, він довше піддається УФ-випромінюванню. Цей шлях розкладання для SDZ можливий лише в обмежених межах на грунтах. Фотохімічна деградація сильно залежить від значення рН і, отже, від оточуючих компонентів. У разі фотохімічної деградації домінує непрямий фотоліз (Wolters and Steffens, 2005). Компоненти, збуджені світловими квантами, можуть передавати цю стимуляцію SDZ і, таким чином, стимулювати її руйнування. Фоточутливі речовини можуть призвести до збільшення фотодеградації, наприклад, перекис водню, гумінові кислоти, фульвокислоти та ацетон (Sukul et al. 2008).! 27!

Вступ 1.2.7 Деградація SDZ у ссавців Під час біотрансформації SDZ у свиней виводиться 96% із введених 14 C-мічених SDZ. Це означає, що тварина поглинає лише 4%. Біотрансформація SDZ у свиней була описана Lamshöft та співавт. (2007) детально розглянуто. Радіоактивно мічений SDZ (14 C-SDZ) годували свиней протягом чотирьох днів, а їх екскреції (гній) збирали щодня протягом 10 днів після введення. Зібрані зразки суспензії аналізували на SDZ та його метаболіти. 44% SDZ виводилося разом з основними метаболітами. Основними виявленими метаболітами були ацетил-SDZ (21%) та 4-OH-SDZ (26%). Іншими вторинними метаболітами були N-формил-сульфадіазин (0,1%) та N-ацетил-4-сульфадіазин (1,8%). Максимальна екскреція відбулася на шосту добу після введення. При розподілі активності всередині гною 80% виявлено у твердій речовині та 20% у рідкій фазі. На рисунку 7 показано продукти деградації SDZ у свиней. Рис. 7: Деградація 14 C-SDZ шляхом біотрансформації, (* = розташування позначки 14 C) (Lamshöft et al., 2007).! 28!

Вступ Розпад зазвичай відбувається у ссавців у дві фази. На першій фазі ферменти, такі як Монооксигеназа та редуктаза розщеплюють функціональні групи, або, як у гідролазі, приєднуються функціональні групи (-ОН). На другій фазі отриманий метаболіт поєднується з ендогенною водорозчинною речовиною. Це підвищує розчинність у воді речовини, що піддається руйнуванню, і, отже, її можна вивести легше. SDZ виводиться переважно через нирки і лише незначною мірою через печінку та кишечник (Sukul and Spiteller; 2006). SDZ повністю перетворюється назад у форму SDZ у гної з метаболітів (Langhammer, 1989). Таблиця 3: Характеристика двох основних метаболітів 4-OH-SDZ та ацетил-SDZ 4-гідроксисульфадіазину N-ацетил-сульфадіазину (4-OH-SDZ) (ацетил-SDZ) сума форми C 10 H 11 N 4 O 3 SC 12 H 14 N 4 O 4 S молярна вага 267,27г/моль 310,32г/моль! 29!

Матеріал та методи Кальденкірхен (Kal) Браунерде N: 51 18 25 O: 6 12 12 Мерценгаузен (Mer) Парабраунерде N: 50 55 50 O: 6 17 47 Рис. 8: Огляд місцезнаходження полів: Merzenhausen (Mer) та Kaldenkirchen (Kal) в NRW.! 32!

Матеріал та методи Рис. 9: Схематичне креслення зовнішньої лізиметрової системи ICG-4 із заглибленим, кутовим 1 м! Монолітом підлоги (Pütz, 1993).! 34!

Матеріал та методи 2.3 Характеристика досліджуваної речовини Рідкий гній, що використовується для цього експерименту, з експериментів з годівлі, як описано Lamshöft et al. (2007) Розділ 1.2.7. 14 C-SDZ, що використовувались із чистотою 99%, мав питому активність 8,6 МБк мг -1 і вироблявся Bayer AG, Вупперталь. SDZ був радіоактивно мічений на атомі 2C анілінового кільця (14 C-SDZ), див. Малюнок 11. SDZ, мічений 14 C, змішували з немеченим SDZ у співвідношенні 1:20 (мас./Мас.). SDZ без маркування постачав Fluka, Seelze. Радіоактивно мічений SDZ (14 C-SDZ) годували двом свиням. Паралельно немічений SDZ вводили перорально двом іншим свиням протягом 4 днів. Тварини, які отримували 14 C-SDZ, отримували загальну дозу 540 мг d -1 (928,8 МБк). Це відповідає 30 мг кг -1 д -1 маси тіла. Тварини, які отримували немаркований SDZ, отримували загальну дозу 570 мг кг −1 d −1 маси тіла. Зразки рідкого гною, зібрані щодня протягом 10 днів, аналізували за допомогою детектування 14 С. Мал. 11: 14-мічений сульфадіазин (14 C-SDZ) (* = місце розмітки 14-С) (Lamshöft et al. 2007) 37

Матеріал і методи 2.4.2 Приготування зразків ґрунту Для наступних аналізів ґрунт просівали на 2 мм і переносили в поліетиленові пакети. Потім значення pH та вологість ґрунту визначали у вологому ґрунті. Для подальших аналізів грунт сушили при 105 ° С до постійної ваги. Потім приблизно 200 г гомогенізували за допомогою планетарного млина (Retsch PM4) (15 хв при 250 об/хв; Förster et al., 2009). У випадку з планетарним млином відцентрова сила притискає подрібнений матеріал (зразок ґрунту) шліфувальними кульками (п’ять штук) до стінки шліфувальної банки і тим самим подрібнює його через тертя. Схематичне зображення робочих кроків можна побачити на малюнку 12. Польово-свіжий ґрунт на 2 мм сім супутніх параметрів (рН-значення, вологість ґрунту) -сушіння -гомогенізація -екстракція ґрунту -Окислювач -LSC-аналіз -LC-MS/MS Рис. 39!

Матеріал та методи 2.5 Супровідні параметри 2.5.1 Визначення значення рН Значення рН визначають на основі DIN ISO 10390. Значення рН визначають у суспензії ґрунту та розчину хлориду кальцію (0,01 М) через одну годину витримки при періодичному змішуванні з рН-метром. Перед використанням pH-метр калібрують за допомогою стандартних буферних розчинів ph 4 і ph 7 (Blume et al. 2000). Умови аналізу Було проведено три повтори для кожного шару ґрунту. ph-метр: Mettler Toledo 1120X Вага: 10 г сухий на повітрі ґрунт Реагент: 25 мл 0,01 М розчину хлористого кальцію 2.5.2 Визначення вологості ґрунту Вологість ґрунту є одним з найпростіших параметрів для опису водних умов у ґрунті. Вологість ґрунту вимірюється не прямо, а опосередковано, тобто гравіметрично, через об’єм ваги. Свіжий з поля вологий грунт зважують і сушать до постійної ваги. Визначення вологості ґрунту проводиться на основі DIN ISO 11465 (1996-12). Вологість ґрунту дається відносно вологої маси ґрунту у% від маси. Умови аналізу Було проведено три повтори для кожного шару ґрунту. Суха окалина: Mettler Toledo HB43-S Вага галогену: 0,3 г-2 г ґрунту! 40!

Матеріал і методи Таблиця 6: Схематична послідовність послідовного вилучення згідно з Förster et al. (2009). Зважування: 10 г ґрунту в центрифужних пробірках Екстракція CaCl 2 Екстракція Me-OH Ацето. Екстракція H 2 O -Реагент: 25 мл, 0,01 М розчину CaCl 2 -24 год струшування над головою -центрифугування * -декантація-зважування Відміряйте надосадову рідину -1 мл у LSC (сцинтилятор: 10 мл Ultima Gold) -реагент: 25 мл, метанол -4 год, струшуючи над головою -центрифугування * -декантація-зважте супернатант-міру -2 мл у LSC (сцинтилятор: 10 мл Instagel) -Микрохвильове розщеплення -Реагент: 50 мл 1: 4 (v: v) ацетонітрил: вода! Візьміть 20 мл із суспензії ґрунту-розчинника -центрифугування ** -декантація-зважування надосадової рідини -1 мл в LSC (сцинтилятор: 10 мл Instagel) Залишок екстракту - центрифугування * - декантація - зважування надосадової рідини - викидання супернатанту сушить дно в пробірках центрифуги для подальшого спалювання в окислювачі *: Allegra 6KR, 30 хв при 900 * g **: J2-21 HS, 30 хв при 40000 * г! 42!

Матеріал і методи Таблиця 7: Робочі етапи очищення екстрактів CaCl 2 з використанням SPE. Крок Об'єм реагенту 1 3 мл метанолу 2 3 мл 5:95 метанолу: дистильована вода 3 3 мл дистильована вода Вода 4 X * CaCl 2 екстракт 5 20 мл дист. Вода 6 Висушіть картридж 15 хв. 7 3 мл метанолу, підкисленого до рН2 *: екстракт CaCl 2 об'єднали перед нанесенням на колонку, 1 мл видалили і виміряли в LSC. Залишок зважували та центрифугували (30 хв при 40000 * г; J2-21HS). Супернатант наносили на колонку. Умови аналізу колонка SPE: Oasis HLB 6 куб.см - 200 мг (Waters Oasis) Вакуумний насос: Vacumbrand SPE приєднання: SPE-24G Кислота для підкислення: 200 мкл мурашиної кислоти! 44!

Матеріал та методи Рис. 13: Експериментальна організація експерименту з посадкою, (вигляд: рослини кукурудзи в посудинах Кіка/Браукмана під стендом для вирощування рослин) Матеріал посудини Кік/Браукмана: 16 штук (Ø = 22 см) Повне добриво: приблизно 3 г синього зерна, COMPO) Ядра кукурудзи: 12 шт. PR39K13 (Early Star, Baiano) Тереза: Mettler Toledo G5002-2 Суха луска: Mettler Toledo HB43-S Галоген Інше: алюмінієва фольга, мірна чашка, ручна лопата, складне правило! 46!

Матеріал та методи 2.8.2 Установки для відбору проб Експеримент закінчився приблизно через 80 днів. Були відзначені загальна вага випробувальної установки, вага судин Кіка/Браукмана, надземні (стебла та листя) та підземні частини рослин та вага ґрунту. Ризосфера піддавалась лише грубому подрібненню крихти пальцями. Грунт відокремлювали від решти дрібних і тонких коренів просіюванням (