Університет Шербрука

Університет Шербрука Регуляція рецептора P2X7 глюкозою та її ефекторами C/EBPa та епітеліальними клітинами кишечника в Дисертація, представлена ​​Модом Білодо. .Sc.) З клітинної біології Шербрук, Квебек, Канада * 26 листопада 2012 р. Члени журі оцінки проф. Феманд-П'єр Гендрон, кафедра анатомії та клітинної біології Менендез, кафедра мікробіології Мод Білодо, 2013

університет

ЗМІСТ. IV СПИСОК ФІГУР. VII СПИСОК СТОЛІВ. IX СПИСОК СКОРОЧЕНЬ. X ВСТУП. 2 1. L in t e s t in. 2 1.1 Ф о н ц і ї і ст р у к т у р е г е н е р а л е. 2 1.2 L a x c r y p t e v il l o sity. 4 1.3 A b so r p t io n e t r é g u l a tio n by g l u c o s e. 7 2. ПОЗАЦІННИЙ АДЕНОЗИН 5 ТРИФОСФАТ. 11 3. Приймання енергоспоживання в ергологічному P 2 сенсі ібл à L A T P. 13 3.1 Лерецепт P 2 X 7. 16 3.2 Ф у нкція приймача P 2 X 7. 18 4,0 л прихованої інформації. 19 4.1 Рег юляційні п р о ц і ї. 19 5.0 Фактори C/E B P. 2 0 5.1 C/E B P a. 2 0 5.1.1 Ізофо р м е с е т л о к а л є а т іо н. 2 0 5.1.2 Ф о н к ц і я. 21 5.1.3 M o d e d e g u l a t io n d o t e n t ie l t r a n s c r ip t io n n e l. 21 5,2 C/E B P стор. 2 2 5.2.1 Ізофо р м е і л о к а л ь. 22 5.2.2 Функції. 22 5.2.3 М о д е д е г у л а т і о н д о т е н т, тобто л т р а н с к р іп т іо н н е л. 23 ГІПОТЕЗ. 25 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ. 26 1. M o d è l e s c e l l u l a ir e. 26 1,1 C a c o - 2. 26 1,2 H E K 2 9 3 T. 26 1,3 IE C -6. 27 2. M o d è l e o u r is. 27 2.1 Основним значенням є C/E B P p in v a l idé e. 27 2.2 Показник NOD. 27

VI 4. Ефект глюкозних мереж у х е р п е с іо н д е ф а к т е р у C/EBPa e t p d a n s th IEC-6 CELLS. 50 5. Вплив глюкоз на екс п р е с іо н о C/EBPa e f a c t e u r s у клітинах CACO-2. 52 6. Роль C/EBPa ET P s u r l a t r a n s a c iw a t io n o P2X7 p r o m o t ers. 54 7. КАПАЦІЯ C/EBPp a c t r a c t io n f a c t io n a u r p r o m o t p e r P2X7 В ГЛЮКОЗНО СТИМУЛОВАНИХ КЛІТИНАХ CACO-2. 56 8. Ефект ізоляції C/EBPa та LIP на попередній перевірці C/EBPP на системі промотора P2X7. 59 9. Встановіть інформацію про те, що це за допомогою P2X7 в МОДЕЛІ КЛІТИНИ, ІНВАЛІДОВАНОЇ ДЛЯ ФАКТОРА ТРАНСКРІПЦІЇ C/EBPP. 62 10. Враження недійсної ідентифікації C/EBPp, що виражається в записі, є попереднім повідомленням про P2X7, GLUT2 та C/EB Pa. 64 11. Im pa ctdud ia b è tesurl 'express io ndufacteurdetran sc r ip t io n C/EBPp, P2X7 ПРИЙМАЧ І ТРАНСПОРТЕР GLUT2 У МОДЕЛІ NOD MOUSE. Несправність! Невизначений прапор i. ОБГОВОРЕННЯ. 73 ПОДЯКИ. 83 ЛІТЕРАТУРА. 84

Таблиця 1: Праймери, що використовуються для аналізу Q-PCR. 29 Таблиця 2: Перелік первинних антитіл, що використовуються для імуноблотів. 31 Таблиця 3: Перелік вторинних антитіл, що використовуються для імуноблотів. 32 Таблиця 4: Праймери, що використовуються для ампліфікації ПЛР людського промотору P2X7R. 33 Таблиця 5: Праймери, що використовуються для ПЛР-ампліфікації усіченого людського промотору P2X7R. 36 Таблиця 6: Конструкції промотору P2X7. 39

L is tedesabr é v ia t io ns AC ADP DNA AMP c RNA ATP BzATP C/EBP ChIP CREB DAG ERK G-CSF GLUT IL IP3 LAP LAP MAPK NOD NF-kB oatp P300/CBP PKA PKB PKC PI3K PLC adenylate cyclapha adenoine diclaphate ad позаклітинний дипосфат дезоксирибонуклеїнова кислота Циклічний AMP рибонуклеїнова кислота аденозин 5 трифосфат 2,3 -о- (бензоїл-4-бензоїл) -atp CCAAT/енхансер-зв'язуючі білки хроматин імунопреципітаційний табір-реакція-зв'язуючий елемент білок діацилгліцерол Екстрацелюлярні регульовані сигналом кінази колональні гранулози стимулюючий фактор транспортери глюкози інтерлейкін інозитол 1,4,5-трифосфат Білок, що активує печінку Білок, що інгібує печінку Мітоген-активована протеїнкіназа не ожиріння діабетичний ядерний фактор-каппа B аденозин 5-трифосфат періодат окислений p300/CREB зв’язуючий протеїн кіназа A протеїнкіназа B протеїнкіназа C фосфоїнозитид-3-кіназа фосфоліпаза С

XI Q-PCR кількісна полімеразна ланцюгова реакція Rb ретинобластома Ser serine SGLT1 транспортер натрію-глюкози 1 STAT сигнальні перетворювачі та активатори транскрипції T IR рецептор рецептора типу 1 TB P TATA короб, що зв’язує білок Thr треонін TNF фактор некрозу пухлини WT дикий тип

3 Травна система Жовчний міхур Q. Стравохід Печінка Дванадцятипала кишка Висхідна товста кишка Кишечник Шлунок Підшлункова залоза Поперечна ободова кишка Низхідна кишка Sigmolde Rectum Рисунок 1: Травна система Травна система включає кілька органів, показаних на цій діаграмі, а саме рот, стравохід, шлунок, печінку, підшлункову залозу, тонку кишку, товсту кишку та задній прохід (змінено з http://www.maalox.fr.). y * '.; -v. Задній прохід

5 верхівкова мембрана, глікокалікс. Цей захисний шар складається з набору цукрів, присутніх у мембранних білках. Глікокалікс захищає від ферментів та хімічних сполук, присутніх у просвіті кишечника (Becker et al., 2010). З іншого боку, як ми бачимо на малюнку 2, існує кілька інших спеціалізованих типів клітин, які відповідають за різні функції, важливі для цілісності органів (Alberts et al., 2008). Окрім ентероцитів, у ворсинах ми знаходимо келихоподібні клітини. Ці клітини відповідають за виділення слизу, який утримує кишкову флору подалі від епітелію та змащує кишковий вміст для полегшення руху їжі (Cheng, 1974). Є також ентероендокринні клітини, які утворюють дуже великий ендокринний орган. Вони частково відповідають за нормальне функціонування кишечника та за зв'язок з іншими органами, включаючи підшлункову залозу та печінку (Roth and Gordon, 1990). Існує 20 типів ентероендокринних клітин, які спеціалізуються на секреції різних гормонів. Наприклад, клітини S-типу переважно виділяють секретин (Bloom and Fawcett, 1986).

6 Anjflbinoaafr pnumctcn <> (Scw # De "Cors *" 9 "E nwoendocnne Gobtet m" puft Enterocyte M-Cells * AWI1 Рисунок 2: Модель диференціації різних типів кишкових клітин. Діаграма зліва представляє вісь крипти-ворсин оскільки різні типи клітин та діаграма праворуч представляють різні сигнали, що регулюють диференціацію типів клітин, що є в кишечнику (Gerbe et al., 2011).

9 ДО НИЗЬКОГО СВІТЛОГО НИЗКОГО НИСКОГО їжі Низька концентрація цукрів ЛЕГКА КРОВЬ Велика концентрація цукрів Сама кров 2 N a \, 2N має мало, глюкоза 5 мм глюкоза багато глюкози mako se _ з М дієтичної базолатеральної мембрани багато г глюкоза g читається також Рисунок 3: Налаштований механізм всмоктування глюкози в кишечнику до і після їжі. (A) Перед їжею вся глюкоза захоплюється транспортером SGLT1 на апікальній мембрані ентероцитів. Транспортер Glut2 локалізований на базолатеральному рівні і дозволяє транспортувати глюкозу з крові до ентероцитів, щоб підтримувати їх запас енергії. (B) Після їжі Glut2 швидко вводиться в апікальну мембрану ентероцитів з внутрішньоклітинних везикул і стає головним компонентом поглинання цукру. На базолатеральному рівні Glut2 забезпечує вихід глюкози та фруктози в кров. (Змінено з Kellett and Brot-Laroche, 2005).

10 1 -Між прийомами їжі глюкоза 2- Їжа, багата цукром, глюкоза 3- Після секреції глюкози інсуліном глюкоза глюкоза глюкоза крові глюкоза глюкоза інсулін Малюнок 4: Регулювання експресії GLUT2 в апікальній мембрані ентероцитів. (1) Перед їжею GLUT2 в основному присутній у везикулі зберігання поблизу верхівкової мембрани. (2) Висока концентрація глюкози в просвіті кишечника, присутній після їжі, стимулює злиття міхурів, що зберігаються, з апікальною мембраною, що призводить до збільшення щільності GLUT2 на мембрані. (3) Збільшення концентрації глюкози в крові стимулює секрецію інсуліну р-клітинами підшлункової залози, що стимулює інтерналізацію транспортера GLUT2 (Tobin et al., 2008).

12 A- НОРМАЛЬНІ УМОВИ ATP 10-100 мкм Апікальні транспортери MDR1 CFTR Connexins 1 ATP Везикулярний секрет ADP-канали Нуклеотид/нуклеозидний обмінник Базолатеральний B ПАТОЛОГІЧНІ УМОВИ rî ATP (pm) ATP (pm до mm) i Везикулярний секрет Лізис клітин/Порушення клітин Рисунок 5: Механізми вивільнення АТФ у позаклітинному середовищі. (А) За нормальних умов АТФ вивільняється у позаклітинне середовище транспортерами, везикулярною секрецією, каналами або нуклеотидними/нуклеозидними обмінниками. Позаклітинна концентрація становить приблизно 10-100 нм. (B) За патологічних станів везикулярна секреція та лізис або розпад клітин призведе до викиду АТФ у позаклітинне середовище. Позаклітинна концентрація АТФ буде порядку мікро- або мілімолярного. Незалежно від клітинного стану, внутрішньоклітинна концентрація АТФ становить від 3 до 10 мм (адаптовано від Schwiebert and Zsembery, 2003).

14 трифосфат (IP3) та діацилгліцерин (DAG). L IP3 пов'язує свій рецептор з мембраною ендоплазматичної сітки, щоб мобілізувати запас кальцію. На противагу цьому, активація рецепторів Р2Х дозволяє безпосередньо потрапляти позаклітинний кальцій. На відміну від цього, було показано, що активація іонотропного рецептора P2X7 інгібує глюкозозалежну секрецію інсуліну (Lee et al., 2008). Ця особлива функція P2X7 може бути пов'язана з його функцією як негативного регулятора GLUT2, як ми показали (Bourzac et al., 2013), оскільки GLUT2 має важливе значення для надходження глюкози в Р-клітини підшлункової залози, а отже до активації секреції інсуліну (Petit et al., 2009).

15 K *, charmai (SURI-KM.2), Аденозин L-typ »C * 2 'channsl ІНСУЛІН Рисунок 6: Участь рецепторів Р2 у секреції інсуліну р-клітинами підшлункової залози. АТФ виділяється нервовими закінченнями, а також гранулами, що секретують інсулін. Нуклеотиди регулюють секрецію інсуліну, стимулюючи рецептори P2X, тим самим дозволяючи приплив кальцію, і стимулюючи рецептори P2Y, зчеплені з білками G. Рецептори P2Y дозволяють активувати фосфоліпазу C (PLC), що призводить до утворення инозитол 1,4,5-трифосфату (IP3 ), що спричиняє виділення кальцію, що зберігається в ендоплазматичній сітці. Також відбувається утворення діацилгліцерину (DAG), який активує сигнальний шлях протеїнкінази С (РКС). P2X також включає аденілатциклазу (AC) та циклічний цикл AMP (cAMP) - протеїнкінази A (PKA). Все це сприяє секреції інсуліну. Сигналізація АТФ обмежена внаслідок його гідролізу за допомогою типу ектонуклеозидів трифосфат дифосфогідролаз (NTPDases) (Petit et al., 2009).

шлунково-кишкові та судинні шкіра та гладкі м’язи (North, 2002; Cheewatrakoolpong et al., 2005; Volonté et al., 2006). Fura-2/FA lo d u re d «p ro p id iu m B rom ura d 'eth y d lu m 9 0 0 C147 H213 D еполяризація плазмової мамбрани ЗАКРИТИЙ ПОРОВИЙ КАНАЛ Рисунок 7: Будова та активація рецептора P2X7. Ліва фігура представляє унікальну кінетику активації рецептора P2X7, а права фігура представляє особливу структуру мономеру рецептора P2X7 з довгим С-кінцевим хвостом. (Адаптовано з Kim et al., 2001; Denlinger et al., 2006).

Qiagen Ротор-ген 6000. Отримані дані повідомляли контрольному гену білка, що зв’язує TATA, для нормалізації результатів. Таблиця 1: Праймери, що використовуються для аналізу Q-PCR. Назва праймера Цільові гени Послідовність сенсу (5-3) Антисмислова послідовність (5-3) hp2x7 242-524 HP2X7 AGC TGT ACC AGC TGC GGG TCC ATC (h = людина) GGA AAG AGC CT CAT CCC TTT Qr-P2X7 RP2X7 CAG GTG TTT ACC CCT CCT GT CTT GCA GAC TTT TCC CAA GC MP2X7-4 MP2X7 ACA GCT TCC GCC AGG TCG GAG AAG (M = миша) GCC TGG AT TCC ATC TGG GG mc/ebpa MC/EBP CCC ACT CAG CTT GCT GGC GAC ATA ACA ACA GG CAG TAC AC Mglut2-1 MGLUT2 CCA GCT TTG CAG TGG GCG GA GAT GAG GGC GTG TGC CGG TC Qhrs Gapdh H/R/M CCA AAG TTG TCA GTG AAG GTC GGT GAPDH TGG ATG AC GTGc GTG fg gpg ) HTBP TGA GGA TAA GAG AGC CAC GAG CAC AAG GCC TTC TAA CCT Щур TBP qpcr (S/AS) GAA RTBP TAT AAT CCC AAG CGG TTT GC CCC ACC ATG TTC TGG ATC TT Pr hp2x7 910 тестовий промоутер TGA AA TG TGT CTC TTG 1 мінімум TGA ATG AAT CAA GGA GAA AG 2 0 0 bp P2X7

37 4.2 Побудова векторів pgl4.10/prhp2x7-1200, prhp2x7-800, prhp2x7-400 та prhp2x7-200, пов'язаних з люциферазою. Для отримання усічених послідовностей промотору гена P2X7 проводили ПЛР з праймери sens pr -hp2x7r-400, pr-hp2x7r-800, pr-hp2x7r-400 та prhp2x7r-200 з антисмисловим праймером pr-hp2x7r-as від вектора ДНК pgl4.10/prhp2x7r (табл. 5). Фрагменти ДНК отримували шляхом міграції агарозного гелю з подальшою екстракцією ДНК-агарози, як описано раніше. Потім зібрані фрагменти вставляли у вектор TOPO і субклонували в pgl4.10, як описано вище. Таблиця 5: Праймери, що використовуються для ПЛР-ампліфікації усіченого промотору P2X7 людини Назва Послідовність Концентрація Tm (C) (пмоль/л) prhp2xr 200 (Sens) 5'- GCTAGCCACAGCCACATGTGGGGCCA -3 '68 .8 100 prhp2x7-400 (Sens) 5 '- GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG -3 '62, 9 100 prhp2xr 800 (Sens) 5'- GCTAGCTTTGGTGATGTGCGTAGCTC -3 '61,5 100 prhp2x7-1200 (Sens) 5'- GCTAGCAACAGAAagGGATCAAGCCT-GCTAGCT -3 '60.

Флуоресценцію спостерігали за допомогою мікроскопа Leica DM2500 з камерою Leica MPS60 (Quorum Technologies Inc., Guelph, ON, Канада). 7. Статистичний аналіз Статистичні ймовірності обчислювали за допомогою неспареного t-критерію Стьюдента або дисперсійного тесту ANOVA, як описано в легендах рисунків.

45 шляхом альтернативного сплайсингу генів (Cheewatrakoolpong et al., 2005), і ми підозрюємо, що різні ізоформи цього рецептора експресуються залежно від стану диференціювання клітин Сако-2. Праймери, що використовуються для визначення експресії рецептора P2X7, ампліфікують послідовність, яка включає частину кінця екзона 1 і частину початку екзону 2. Ось чому для спрощення експериментів ми вирішили використовувати клітини Caco.2 при злитті та не повністю диференційовані. Експерименти, подібні до експериментів, проведених на клітинах IEC-6, дозволили нам визначити, що така ж зміна експресії виявилась і в клітинах Caco-2, але цього разу збільшення є значним після 45 хв стимуляції (рис. 8B).

46 6 -і р 27Т г; > - CQ c t: O "Z 0. L" a x Ui 4- n S- X Стимуляція глюкозою (хв) Рисунок 8: Глюкоза, здається, підвищує експресію рецептора P2X7 у СЕІ. Екстракти мРНК із стимульованих глюкозою клітин IEC-6 (A) та Caco-2 (B) аналізували за допомогою Q-PCR та повідомляли про експресію TBP. Контроль (CTR) - це екстракт клітин IEC-6 або Caco-2, який не позбавлений глюкози і середня концентрація глюкози 4,5 г/л. Результати відповідають 6 окремим експериментам, а використовуваний статистичний тест - це тест anova.

49 0 1 4,5 Концентрація глюкози (г/л) ЛАМІН B 0 1 4,5 Концентрація глюкози (г/л) ЛАМІН BP 5 ii 6 il 4 Si 2H C l Û - ІТ Стимуляція глюкозою (хв) Стимуляція глюкозою (хв) Рисунок 12: Активація фактора транскрипції C/EBPp та збільшення експресії фактора транскрипції C/EBPa як функції глюкози. Імуноблоти, спрямовані проти C/EBPa, природного C/EBPP, або LAP і LIP, і фосфорильовані на Thr235. Експресія ламіну В представлена ​​як перевірка навантаження та цілісності зразка. Використовувані зразки є екстрактами ядерних білків із клітин Сако-2, стимульованих глюкозою. CTR - це екстракт ядерних білків із клітин Caco-2, які не позбавлені глюкози і середня концентрація яких залишається на рівні 4,5 г/л глюкози. Результати є репрезентативними для 4 окремих експериментів. Панелі B-C-D-E представляють денситометричний аналіз вищезазначених імуноблотів.

Рисунок 13: Регулювання експресії рецептора P2X7 на рівні транскрипції за допомогою факторів транскрипції C/EBPa та f $. Аналізи люциферази проводили в клітинах HEK293T, котрансфікованих вектором pcdna, що містить ген фактора транскрипції (A) C/EBP (3 або (B) C/EBPa), та вектором pgl4.10, що містить різні конструкції промотору P2X7, описаний у таблиці 6. Відносні результати люмінесценції виражаються як відносні зміни експресії порівняно з контролем pgl4.10, де клітини котрансфікували порожніми векторами pgl4.10 та pcdna3.1 (-). середнє значення 3 експериментів, проведених у трьох примірниках, виражається як середнє значення ± SEM. Статистичну значимість визначали за допомогою непарного t-тесту.

57 80-1 H- 60,1 T io 40-1 _ L 2 o lr * i p CL s 0 1,0 p