Від Інституту тваринництва і селекції Університету Гогенхайма Департамент тваринництва і
Від Інституту тваринництва та селекційного університету Гогенгейма Предметна область: Тваринництво та фізіологія продуктивності Р. Клаус Збільшення утворення бутиратів шляхом згодовування стійкого крохмалю у свиней: Наслідки регулювання мітозу та апоптозу слизової ободової кишки Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук, представлена на факультеті сільськогосподарських наук Йоахімом Менчелем з Ландсхута 2004 р.
Від Інституту тваринництва та селекції Університету Гогенхейма Предметна область: Тваринництво та фізіологія продуктивності Р. Клаус Збільшення утворення бутиратів шляхом згодовування стійкого крохмалю у свиней: наслідки регулювання мітозу та апоптозу слизової оболонки товстої кишки Дисертація на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук, представлена на факультеті сільськогосподарських наук Йоахімом Менчелем з Ландсхута 2004 р.
Ця робота була прийнята 12 березня 2004 р. Факультетом сільськогосподарських наук Університету Хогенхайма як дисертація на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук. День усного іспиту: 25 березня 2004 р. 1-й заступник декана: проф. К. Стар Доповідач, 1-й екзаменатор: проф. Р. Клаус Співдоповідач, 2-й екзаменатор: проф. Х. Шенкель 3-й екзаменатор: проф. Р. Мосентин
Огляд літератури 2 Огляд літератури 2.1 Огляд травної системи свині Травна система свині поділяється на голову та тулуб. Головний кишечник складається з носової, ротової та глоткової порожнин. Стовбур можна розділити на передню кишку (стравохід і шлунок), середню або тонку кишку (дванадцятипала кишка, тонка і клубова кишки), пряму або товсту кишку (сліпа кишка, товста кишка і пряма кишка) та задній прохід (Liebich, 1998). Структура стовбурової кишки схематично показана на рис. 1. 1: Схематичне зображення стовбурової кишки у свиней (за Кохом та Бергом, 1990) 2I
Огляд літератури Довжина всього кишечника у свиней становить 20-27 м, приблизно в 15 разів більше довжини тіла. Дванадцятипала кишка має розмір приблизно 0,95 м, а вся тонка кишка з тонкою кишкою та клубовою кишкою приблизно 15-20 м. Довжина товстої кишки становить близько 6 м, а товстої кишки близько 5 м (Loeffler, 1991; Bucher & Wartenberg, 1991). 2.1.1 Морфологічні принципи шлунково-кишкового тракту та його особливі особливості Усі відділи стовбурової кишки мають схожий базовий план (Liebich, 1998), але існують значні відмінності щодо їх будови стінок (рис. 2). Тонка кишка складається з численних крипт і ворсинок. Скрипти коротші, ніж у товстому кишечнику. Навпаки, у товстому кишечнику немає ворсинок. Характерним є утворення крипт (glandulae intestinales), вони нерозгалужені і лежать близько один до одного. Власні травні ферменти не виводяться зі слизової оболонки товстої кишки. Крім того, товстий кишечник має здатність виводити погано розчинні речовини, такі як метали. Крім того, на відміну від тонкої кишки, у товстій кишці фізіологічними є не лише перистальтичні, а й антиперистальтичні рухи (Bucher & Wartenberg, 1991). Рис. 2: Різні структури стінок тонкої кишки та товстої кишки (після Поттена, 1992) 3
Огляд літератури 2.1.2 Морфологічні особливості товстої кишки Товста кишка розвивається під час ембріогенезу із середини та прямої кишки. Висхідна товста і проксимальна поперечна ободова кишка розвиваються з середньої кишки, а дистальна поперечна і точна кишка виникають з прямої кишки. На додаток до цього різного розвитку, існують також травні фізіологічні відмінності, тому основне місце бродіння знаходиться в проксимальній ділянці, але може також зміщуватися дистально залежно від поглиненого субстрату. Крім того, травна пульпа все більше потовщується в дистальній ділянці. З цих причин у цій роботі товста кишка називається проксимальною та дистальною ободовою кишкою. Проксимальна частина складається з висхідної ободової кишки та проксимальної зони поперечної ободової кишки, дистальної області дистальної поперечної ободової кишки та низхідної ободової кишки. 2.1.2.1 Загальна конструкція стінки товстої кишки Основний план конструкції товстої кишки складається з різних шаруватих тканин (рис. 3); від просвіту назовні вони називаються слизовою оболонкою оболонки, підслизовою оболонкою тіла, м’язовою оболонкою оболонки, підшкірною оболонкою та оболонковою оболонкою. 3: Поперечний розріз товстої кишки (Liebich, 1998) 4I
Огляд літератури 2.2 Завдання шлунково-кишкового тракту Першочерговим завданням шлунково-кишкового тракту є розщеплення спожитої їжі до її компонентів до такої міри, щоб вона могла всмоктуватися у внутрішню частину тіла. Процес травлення починається з механічного розщеплення компонентів їжі в ротовій порожнині. Після ковтання їжі вуглеводи, білки та жири перетравлюються. Травлення в середній кишці відбувається за допомогою ферментів. Огляд власних ферментів організму під час розщеплення основних поживних речовин наведено на рис. 5. Рис. 5: Огляд власних ферментів організму під час розщеплення основних поживних речовин (згідно Simon, 1995) Ефективність ферментів тонкої кишки у товстій кишці постійно знижується. Натомість кишкові бактерії та найпростіші, що розщеплюють вуглеводи та білки, беруть на себе переварювання решти компонентів їжі у товстій кишці. На додаток до засвоєння мінералів і води, завданнями товстого кишечника є синтез вітамінів групи В і К і головним чином 7
Огляд літератури Таблиця 3: Молярні співвідношення ацетату, пропіонату та бутирату після 24 годин інкубації калу людини з різними вуглеводами (згідно Cummings & Macfarlane, 1997) Вихід субстрату SCFA (%) Молярне співвідношення (%) ацетат пропіонат бутиратний крохмаль 49 62 15 23 висівки (пшениця, 40 64 16 20 вівса) фруктоолігосакарид - 78 14 8 пектини 39 80 12 8 інші NSP 38 63 22 8, включаючи: гуарова камедь арабіногалактан 62 43 59 57 27 31 11 11 харчові компоненти, такі як целюлоза, геміцелюлоза, пентозани (Berggren et al., 1993; Bourquin et al., 1993; Knudsen et al., 1993) призводять до незначного бродіння бутирату, тоді як досягаються підвищені концентрації бутирату, особливо при стійких крохмалях. Таблиця 4: Молярні співвідношення ацетату, пропіонату та бутирату після 24 годин інкубації свинячих фекалій з різними крохмалями (згідно з Мартіном та ін., 1998) Субстратні молярні співвідношення (%) ацетат пропіонат бутират сирий пшеничний крохмаль 56 25 17 сирий кукурудзяний крохмаль 62 21 16 крохмаль гороховий сирий 62 21 15 крохмаль амілома сирий 47 28 23 ретроградований 54 28 14 крохмаль амілома сирий картопляний крохмаль 55 19 25 11
Огляд літератури щодо підтримки гомеостазу тканин. Це тісно пов’язано з мітозом, оскільки якщо кількість клітин у тканині залишається незмінним, утворюється стільки клітин, скільки втрачається внаслідок загибелі клітин (Kerr et al., 1972). Відповідно, чітко визначені механізми регулювання втрати клітин повинні існувати в тканинах з постійною клітинною продукцією (Ansari & Hall, 1992). Їх завданнями є видалення зайвих, пошкоджених або інфікованих клітин (Томпсон, 1995). Помилки в апоптозі можуть призвести до різних клінічних картин. Якщо швидкість мітозу залишається незмінною, збільшення призводить до атрофії тканин. З одного боку, активація проапоптотичних механізмів контролю може призвести до дегенерації тканин (Que & Gores, 1997), з іншого боку, помилки в апоптозі сприяють перетворенню нормальної тканини в новоутворену тканину. З цих причин обговорюються фармакологічні стратегії щодо впливу на апоптоз. Таким чином, інгібування апоптозу епітеліальних клітин може покращити процеси оновлення тканин та відновлення шлунково-кишкового тракту, тоді як індукція апоптозу в злоякісних тканинах може мати високу терапевтичну користь (Que & Gores, 1997). 2.4.1 Клітинний поділ: мітоз Процес клітинного ділення, завдяки якому створюється нова клітина з такою ж кількістю хромосом, як у вихідній клітині, називається мітозом. При мітозі кожна хромосома розпадається на дві рівні частини, які рухаються до протилежних кінців клітини. Після поділу клітин кожна з двох дочірніх клітин має таку ж кількість хромосом і генів, як і вихідна клітина. Просто побудовані найпростіші та деякі багатоклітинні види розмножуються через мітоз; Крім того, за допомогою цього процесу (гіперплазія) ростуть живі істоти, і використовувані клітини замінюються. Це на відміну від росту клітин (гіпертрофія), який слід розуміти лише як збільшення маси клітини або її розміру. У слизовій оболонці шлунково-кишкового тракту ентероцити завжди виходять із стовбурових клітин, які розташовані в нижніх ділянках крипти (Bach et al., 2000). Щоб ідентифікувати проліферуючу клітину, слід виявити специфічні зміни, наприклад, генні продукти, пов’язані з проліферацією. До представників цих генів, пов’язаних з проліферацією, належать: обговорювали онкогени. Хронологічний клітинний цикл (рис. 7) має велике значення для ідентифікації мітозу. Це поділяється на чотири фази (G1, S, G2 і M). Під час S Pha- 14 I
Огляд літератури se відбувається під час синтезу ДНК під час мітозу фази М з поділом хромосом. На фазах G1 і G2 (фази зазору) проводиться підготовка до процесів на наступних фазах S і M. Клітини, які не проходять клітинний цикл, знаходяться у фазі G0. Початок мітозу MR G2 G0 G1 S Початок синтезу ДНК Рис. 7: Схематичне зображення клітинного циклу Виявлення мітозу можна визначити за допомогою певних маркерів, таких як PCNA (проліферуючий клітинний ядерний антиген) та виявлення ядерного антигену (Ki67) (Potten & Loeffler, 1990). Білок PCNA синтезується в клітинах, що діляться. Антитіла, спрямовані проти цього білка, реагують з клітинами, що діляться, включаючи пухлинні клітини, але не з клітинами у фазі спокою (Mathews et al. 1984). Антитіло Ki67 виявляє ядерний антиген, який присутній у проліферуючих клітинах, але не в клітинах, що відпочивають. Клітини в циклічних фазах, включаючи G1, є Ki67 позитивними, тоді як клітини у фазі G0 не експресують антиген (Baisch & Gerdes 1990). 15-й
Огляд літератури Рис. 10: Схематичне зображення апоптозу (за Керром, 1993) 2.4.4.2 Перебіг апоптозу Апоптоз можна розпочати, використовуючи різні механізми контролю (рис. 11). У цьому контексті слід розрізняти опосередкований рецепторами шлях апоптозу та мітохондріальний шлях. 21-го
Огляд літератури Опосередкований рецепторами шлях апоптозу ініціюється за допомогою рецепторів, таких як CD95. Зв'язування ліганда CD95 з CD95 індукує сигнальний комплекс, який набирає молекули прокаспази 8 за допомогою FADD (асоційований з Fas білок домену смерті) і тому відповідає за активацію каспази 8 (Hengartner, 2000). Мітохондрії відіграють центральну роль у контролі апоптозу. Мітохондріальний шлях може бути спровокований позаклітинними факторами або пошкодженням ДНК. Білки сімейства Bcl-2 беруть участь у цьому механізмі регулювання. Про- та антиапоптотичні представники цього сімейства контактують у мітохондріях та контролюють вивільнення різних молекул, таких як цитохром с, які разом з Apaf-1 та Прокаспазою 9 можуть активувати ефекторні каспази. Подальші детальні механізми, показані на схемі, не обговорюються далі в цій роботі; більш детальні пояснення можна знайти в публікації Hengartner (2000). Рис. 11: Схема найважливіших шляхів апоптозу (ліворуч: опосередкований рецепторами шлях апоптозу; праворуч: шлях апоптозу мітохондрій, згідно з Hengartner, 2000) 22 I.
Огляд літератури Члени сімейства bcl-2 Мітохондрій Вивільнення цитохрому c Активація каскадного каскадного апоптозу Рис. 12: Модель каскаду апоптозу через Bcl-2, мітохондрії, цитохром c та каспази 2.4.5.1 Білки, що регулюють апоптоз: Bcl-2 Bcl-2 був використаний як протоон ідентифіковані. Вперше ген був виявлений у В-клітинній лімфомі. Експерименти на клітинних лініях мишей також показали вплив bcl-2 на апоптоз (Vaux et al., 1988). Хоча Bcl-2 міститься в багатьох тканинах плода, у дорослих тканинах цей білок в основному експресується в швидко поділяються та диференціюючих клітинах. У подальших дослідженнях було виявлено низку генів, які мають гомології послідовності до bcl-2 (Yang & Korsmeyer, 1996; Reed, 1997). Характеристика амінокислотної послідовності, біологічного ефекту та функції призвела до різних спостережень. Відповідно, сімейство білків Bcl-2 включає обидва вер 25
Огляд літератури Bcl-2, Bcl-X-L, Bid або самостійно (Sattler et al., 1997). Bax протидіє антиапоптотичному білку Bcl-2; чим вищі концентрації Bax порівняно з Bcl-2, тим більший його ефект. Відносні співвідношення гомодимерів Bax/Bax, гетеродимерів Bcl-2/Bax та гомодимерів Bcl-2/Bcl-2 є вирішальними для здійснення апоптозу. Якщо переважають гомодимери Bax, настає загибель клітин; переважання гетеродимерів Bax/Bcl-2, як правило, призводить до виживання клітин (Sato et al., 1994). Однак у деяких дослідженнях також було показано, що, незалежно від ступеня димеризації, Bcl-2 і Bcl-x можуть інгібувати апоптоз або що Bax також може сприяти апоптозу (St Clair et al., 1997; Zha & Reed, 1997) (рис. 13). Крім того, проапоптотичний ефект Бака, здається, не залежить від гетеродимеризації з Bcl-X-L та Bcl-2 (Simonian et al., 1997). a: bax bcl-2 bcl-2 bax b: Рис. 13: Діаграми, що показують білково-білкову взаємодію членів сімейства bcl-2 (a: змінено з Mathers, 1998; b: Sato et al., 1994)