Від медичної клініки з акцентом на гематології, онкології та імунології пухлин - PDF
Від Медичної клініки з акцентом на гематології, онкології та імунології пухлин медичного факультету Charité Universitätsmedizin Berlin ДИСЕРТАЦІЯ Онкоген-індуковане старіння в послідовності колоректальної аденоми-карциноми та його функція як предиктор реакції на 5-FU в первинно метастатичній ситуації для досягнення академічний ступінь Доктор медичних наук (доктор мед. наук), представлений на медичному факультеті Charité Universitätsmedizin Berlin Анною Хаугштеттер зі Штутгарта-Бад-Канштатт
Рецензент: 1. Проф. Д-р. мед. C. A. Schmitt 2. Проф. Д-р. мед. Ф. Р. Гретен 3. Проф. Д-р. мед. Л. Зендер Дата доктора наук: 18 листопада 2011 р. 2
Зміст 1 Вступ 6 1.1 Колоректальна аденокарцинома 6 1.1.1 Епідеміологія колоректальної аденокарциноми 6 1.1.2 Фактори ризику розвитку колоректальної карциноми 6 1.1.3 Прогностично важливі фактори 7 1.1.4 Послідовність карциноми аденоми 8 1.1.5 Онкоген ras 10 6 Терапія колоректальної аденокарциноми 11 1.2 Апоптоз 11 1.3 Старіння 12 1.3.1 Особливості старіння 13 1.3.2 Потенційні маркери старіння 15 1.3.3 Значення індукованого онкогеном старіння in vivo 18 1.3.4 Передчасне старіння та хіміотерапевтичні засоби 19 2 Питання дослідження 22 3 Матеріал та методи 23 3.1 Матеріал 23 3.1.1 Клітинні лінії та бактеріальна лінія 23 3.1.2 Середовище 23 3.1.3 Розчини 24 3.1.4 Плазміди 25 3.1.5 Пристрої та аксесуари 25 3.1.6 Антитіла 27 3
3.2 Методи 28 3.2.1 Культура клітин 29 3.2.1.1 Клітинні лінії 29 3.2.1.2 Субкультура клітинних ліній 30 3.2.1.3 Кріоконсервація клітин 30 3.2.1.4 Кількість клітин, криві росту, життєздатність 30 3.2.2 Ретровірусна інфекція 31 3.2.2.1 Використовувані плазміди 31 3.2. 2.1 Трансформація 31 3.2.2.2 Міні-підготовка ДНК 32 3.2.2.3 Максимальна підготовка ДНК 33 3.2.2.4 Фотометричне визначення концентрації розчину ДНК 33 3.2.2.5 Електрофоретичне розділення фрагментів ДНК 34 3.2.2.6 Трансдукція 34 3.2. 2.6.1 Трансфекція, опосередкована фосфатом кальцію 34 3.2.2.6.2 Інфекція клітин-мішеней 35 3.2.3 Фіксація та введення парафіну елементів управління 35 3.2.4 Методи фарбування 37 3.2.4.1 Імуногістохімія 37 3.2.4.2 Флуоресцентне фарбування SAHF 39 3.2.4.3 SA-beta-Gal - Фарбування 39 3.2.4.4 Оцінка фарбування тканин 40 3.2.5 Вимірювання потокової цитометрії: профіль BrdU-PI 40 3.2.6 Відбір пацієнтів та дані спостереження 41 3.2.7 Аналіз мутації K-ras онкогену 42 3.2.8 Статистика 42 4
4 Результати 43 4.1 Виробництво контролів старіння з фібробластів 43 4.2 Старіння в кріогенних тканинах 47 4.3 Старіння в парафінових тканинах 53 4.4 Оцінка клінічної значимості 65 5 Дискусія 73 5.1 Порівняння з поточною літературою 74 5.2 Критичні зауваження 80 5.3 Перспективи 81 6 Резюме 83 7 Додаток 85 7.1 Бібліографія 85 7.2 Список малюнків 95 7.3 Список таблиць 96 7.4 Список скорочень 97 7.5 Список публікацій 99 8 Подяки 100 9 Автобіографія 101 10 Підписка 103 5
Ініціюючи пошкодження ДНК, на які клітина реагує старінням, передзлоякісна пухлина зупиняє свій ріст. Тканина може захистити себе від прогресування до злоякісної пухлини. Рисунок 5: Індуковане терапією старіння. Роль старіння при передозлоякісних та злоякісних пухлинах. Активація онкогену в нормальних клітинах призводить до початкової гіперпроліферації. У результаті пошкодження ДНК активізує програму супресору пухлини, яка зупиняє зростання передзлоякісної пухлини. Виявлено типові риси старіння. Якщо виникає мутація, яка вимикає програму придушення пухлини, або, як варіант, якщо зменшується супутні фактори, що сприяють старінню, пухлина починає знову рости і розвивається інвазивна злоякісна пухлина. Якщо злоякісну пухлину лікують хіміотерапевтичними препаратами, якщо вона реагує, це призводить до апоптозу самогубства клітини або знову до зупинки старіння кінцевого клітинного циклу. Що саме відбувається в молекулярно-біологічному плані під час прогресування передзлоякісної пухлини в карциному, незрозуміло. З одного боку, можлива мутація ефектора 20
Ініціювання сигнального шляху механізму старіння, наприклад мутація p53, при якій передзлоякісна пухлина починає інвазійно розмножуватися неконтрольовано. Альтернативна модель розглядає старіння в передозлоякісному ураженні як вираження онкогенної активності разом з іншими факторами, що сприяють старінню. Ці фактори можуть включати клітинно-автономні та, можливо, місцеві неклітинно-автономні умови, такі як напр. щільність судин, наявність гіпоксії та цитокінів, що виділяються макрофагами. Потім прогресування в інвазивну карциному пояснюється нижчим тиском, що передує старінню, що дозволяє подолати ОІС. Вирішальна відмінність у цій моделі полягає в тому, що клітини залишаються генетично здатними до старіння. У злоякісній пухлині, що утворилася, ще може бути кілька невеликих застарілих ділянок. Якщо зараз лікувати хіміотерапевтичними препаратами, пухлина може знову зупинитися у старінні або перейти в апоптоз, якщо є відповідь на терапію. 21-го
Матеріал та методи 3 Матеріал та методи 3.1 Матеріал Лабораторні хімічні речовини постачали Merck (Німеччина), Biochrom (Німеччина), Sigma (Німеччина), Roth (Німеччина), Serva Electrophoresis (Німеччина), New England Biolabs (Німеччина), DAKO (Данія) та Gibco (США) отримано на найвищому рівні якості. Прилади та аксесуари, а також матеріали клітинної культури були отримані від Falcon (Німеччина), Eppendorf (Німеччина), Nunc (Німеччина) та Techno Plastic Products (Швейцарія) як стерильні одноразові предмети. Багаторазові матеріали автоклавували. Хімічні речовини та матеріали інших виробників наведені в наступному списку. 3.1.1 Клітинні лінії та лінія бактерій IMR90 American Type Culture Collection (ATCC), США (CCl-186), приєднані диплоїдні фібробласти легенів людини із 16-тижневого плоду Phoenix eco Nolan Lab, США 135 прикріплених клітинних ліній клітин нирок людини 293T E. coli (DH5α) Invitrogen, Німеччина 3.1.2 Середовище середовища для культивування клітин (зберігати при 4 С) Модифіковане середовище орел Дульбекко (DMEM + 4500 мг/л глюкоза + L-глутамін + піруват) + 10-15% FBS + 100 ОД/мл морозильного середовища пеніцилін-стрептоміцин ( зберігати при 4 С) FBS (фетальна теляча сироватка) + 10% ДМСО Лізогенний відвар (ЛБ) середовище 10 г/л триптону + 5 г/л NaCl, (можливо + ампіцилін) 23
Матеріал та методи 3.1.3 Розчини PBS (сольовий розчин, забуференний фосфатом) (зберігати при кімнатній температурі) 8 г NaCl (137 мм) + 0,2 г KCl (2,7 мм) + 1,44 г Na 2 HPO 4 (10 нм) ) + 0,24 г KH 2 PO 4 (2 мм) заповнюють до 800 мл dh 2 O; титруйте до рН 7,4-1 л, залийте розчином dh 2 O S1 (міні-препарат) (зберігайте при 4 C) 50 мМ глюкози + 25 мМ Трис-HCl (ph 8,0) + 10 мМ EDTA (ph 8, 0) у розчині dh 2 O P1 (міні-препарат) (зберігати при 4 С), розчин S1 + 100 мкл/мл РНКази A, додати свіжий в кожному випадку розчин S2 (міні-препарат) (зберігати при кімнатній температурі) 0,2 N NaOH + 1% SDS, тобто 2 O, щоразу готують щоразу розчин S3 (міні-препарат) (зберігати при 4 С) 60 мл 5 М ацетату калію + 11,5 мл оцтової кислоти + 28,5 мл, тобто 2 O 50 x TAE (зберігати при RT) 242 г Trisbase + 57,1 мл крижаної оцтової кислоти + 100 мл 0,5 M EDTA (pH 8,0) SA-бета-Gal-PBS (зберігати при RT) PBS + 1 мм MgCl 2 титрують до pH 6 для тканини людини SA-бета-Гал-Фіксатор SA-бета-Гал-PBS + 2% параформальдегід + 0,25% глутаральдегід 24
Матеріал та методи Розчин X-Gal SA-бета-Gal-PBS + 1 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-індоліл-ß-D-галактозид + 50 мкл/мл 20 х розчин ціаністого калію 20 х розчин ціаністого калію (при 4 C) 820 мг K 3 Fe (CN) 6 + 1,050 г K 4 Fe (CN) 6 x 3h 2 0, залийте до 25 мл PBS Mowiol 4-88 (зберігайте аликвоти при -20 C, попередньо нагрійте до 37 C перед використанням ) Змішайте 8 г Mowiol + 40 мл 0,2 M трис-HCl (pH 8,5) при 50-60 C; Після охолодження: +20 мл гліцерину + 2,5% DABCO QIAamp DNS Mini Kit Quiagen, Німеччина BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit 3130 Генетичний аналізатор, Biosystems, США 3.1.4 Плазміди Плазміда Вставка магістралі Походження pbabe-ras pbabe-puro H-rasV12 Scott Lowe pbabe-empty pbabe-puro - Scott Lowe 3.1.5 Пристрої та аксесуари Біофотометр 8,5 мм Eppendorf, Німеччина Проточний цитометр (сортування клітин, що активується флуоресценцією, FACS) FACSCalibur Becton Dickinson, Німеччина Пристрій вкладання EG1160 Leica, Німеччина 25
Матеріали та методи Електрофорез Джерело живлення E835 Consort, Бельгія Пристрій для зневоднення ASP300 Leica, Німеччина Інкубатор Steri-kult 200 Labotect GmbH, Німеччина Invisorb Плазміда Maxikit Invitek, Німеччина Камера Inteq, Німеччина Kryostat FrigoCut 2800 Reicher-Jung, Німеччина Microtom RM2035 Kr., Німеччина Мікроскоп для флуоресцентного фарбування Zeiss Axioplan Містер Морозний морозильник (1 С в хвилину) Nalgene Labware Лічильна камера Нойбауера вдосконалена Глибина 0,1 мм Парафінові касети Superior Marienfeld, Німеччина Medite, Німеччина Стерильний банк Kendro HeraSafe Гереус, Німеччина Азотний резервуар Thermolyne Scientific 6Plus Locator Термоміксер комфорт 1,5 мл Eppendorf, Німеччина Шафа опалення Функціональна лінія Heraeus, Німеччина Центрифуга Eppendorf 5417 R Eppendorf, Німеччина Центрифуга Heraeus Megafuge 1,0 R Heraeus, Німеччина 26
Матеріал та методи 3.1.6 Походження антигенного антитіла Компанія розщепила каспазу 3/Asp175 Техніка сигналізації клітин кролика, США (# 9661) H3K9me 3 Rabbit Abcam, США (ab8898) HP1 γ миша Chemicon, США (MAB3450) Ki67 миша DAKO, Данія (M7240 ) P16 Mouse Novocastra, Великобританія (NCL-p16-432) P53 Mouse Oncogene, Німеччина (OP43, AB-6) PAI-1 Mouse Novocastra, Великобританія (Ncl-PAI-1) Phospho-Chk2 (Thr68) Технологія сигналізації з кролячих клітин, США (# 2661) Phospho-Erk 1/2 (Thr202/Tyr204) Технологія сигналізації кролячих клітин, США (# 4376) Phospho-H2A.x (Ser139) Технологія сигналізації кролячих клітин, США (# 2577) Phospho-P53 (Ser15) Технологія сигналізації клітин кролика, США (# 9284) PML Mouse DAKO, Данія (M7202) Флуоресцентні вторинні антитіла Anti-Mouse IgG Goat GIBCO Invitrogen, Німеччина, (Alexa Fluor 594; A21121) Флуоресцентна миша Anti-BrdU GIBCO Invitrogen, Німеччина (MD5300 ) Анти-кролячі другі антитіла Осел Діанова, Німеччина LSAB-AP Kit Dako, Данія (K0689) LSAB-HRP Kit Dako, Данія (K0690) 27
Матеріал і методи 3.2 Методи На рисунку 6 наведено огляд експериментальної установки та терміни виконання окремих етапів. Рисунок 6: Огляд методу. Огляд окремих етапів експериментів. Крок А: Виробництво контролів для старіючого фенотипу з фібробластів IMR90. IMR90 були ретровірусно інфіковані ras або порожнім вектором. Після закінчення відбору їх залишали в культурі на шість днів. Протягом цього часу виявився старий фенотип IMR90ras, тоді як IMR90empty продовжував розмножуватися. Були проведені різні тести на старіння, такі як криві росту, аналіз SA-beta-Gal та аналіз клітинного циклу. Інфіковані клітини миттєво заморожували у вигляді клітинних гранул або для кріоконтролю, або зневоднювали для контролю парафіну і вбудовували в парафін. Крок В: Кріоконтролі IMR90 та колоректальні кріоткани (5 нормальних тканин, 12 аденом, 6 карцином) досліджували на старіння за допомогою аналізу SA-бета-Гал та імуногістохімічного виявлення Ki67. Крок C: Парафін IMR90 28