Відновлення пошкоджених сердець для науки
Виправлення ураження, спричиненого інфарктом міокарда, є основним фактором медицини. Сьогодні фахівці з інженерії серцевої тканини здатні запобігти деградації серця після серцевого нападу у щурів.
Завдяки досягненням медицини все більше людей переживають серцевий напад, але третина з них в кінцевому підсумку страждає від серцевої недостатності, що в підсумку вимагає трансплантації, складного, дорогого та обмеженого рішення. Відсутність донорів. Тривалість життя людей, які не отримують трансплантацію, поступово зменшується, і менше 40 відсотків з них все ще живі через п'ять років після першого нападу.
Якби лікарі змогли виправити серцевий напад або просто запобігти його поширенню, мільйони життів змінилися б. Ось чому виготовлення фрагментів живої серцевої тканини людини стало однією з головних цілей тканинної інженерії. Це також одне з найбільш амбіційних. Волокна в серцевому м’язі організовують себе, утворюючи фізичні та нервові зв’язки, які несуть електричні сигнали і дозволяють волокнам синхронізувати скорочення. Шкіра та хрящі менш складні для росту в лабораторії, оскільки вони не васкуляризовані. Для серцевого м’яза основною складністю є постачання тривимірного шматка тканини.
Звичайно, п’ятнадцять років тому перспектива «виробляти» живі тканини поза тілом була схожа на наукову фантастику. Проте біологи та інженери-матеріали досягли помітного прогресу; наприклад, ми розробили підтримку, яка сприяє зростанню серцевих клітин та судин у мертвій зоні серцевого нападу.
У пошуках ідеальної підтримки
Інфаркт міокарда - серцевий напад - зазвичай виникає, коли основна кровоносна судина, що постачає лівий шлуночок серця, перекрита згустком. Частина серцевого м’яза, міокард, позбавлена крові і, отже, кисню, який руйнує клітини (кардіоміоцити) в цій області. Розмір інфаркту залежить від розміру площі, що постачається кровоносною судиною, перш ніж вона заблокується.
Оскільки міоцити погано діляться, вижилі клітини не можуть повторно заселити пошкоджену ділянку. Місцеві стовбурові клітини, які діють як попередники нових клітин в інших тканинах, неефективні в роботі серця і не можуть відновити пошкодження. Навпаки,
нескорочувальні фіброзні клітини поступово замінюють загиблі міоцити. Здорові міоцити навколо інфаркту також можуть загинути, збільшуючи ступінь інфаркту. Під час цього процесу, відомого як ремоделювання, стінка шлуночка в області інфаркту стоншується, а іноді навіть розривається.
В останні роки біологи намагалися відновити ріст серцевої тканини в зоні інфаркту шляхом трансплантації стовбурових клітин з інших тканин, таких як кістковий мозок або м’язи, з надією, що ці клітини адаптуються до навколишнього середовища та виробляють нові кардіоміоцити або стимулюють природну здатність серця до регенерації. На жаль, результати були невтішними: дуже мало стовбурових клітин вижило після трансплантації, і тих, які зазвичай збиралися по краях інфаркту, але без контакту із сусідньою здоровою тканиною або їх проведення. Електричні сигнали, що дозволяють серцевим клітинам синхронізувати свої скорочення.
Ці імплантовані клітини не працюють в зоні пошкодження, оскільки природна структура, яка підтримує живі клітини, зникла. У здоровій тканині позаклітинний матрикс, що складається з структурних білків, таких як колаген, та складних молекул цукру, полісахаридів, виробляє фактори росту та забезпечує фізичну підтримку клітин.
У пошуках ідеальної підтримки
Тоді біологи шукали ідеальне середовище для росту живої тканини, дозволяючи клітинам ділитися і організовуватися в тривимірну тканину. Тоді ці клітини почали б виділяти власний позаклітинний матрикс, каркас розчинився б, залишивши позаду лише здорову тканину. Більше того, каркас стимулював би васкуляризацію нової тканини, кровоносні судини підводять кисень до клітин та евакуюють їхні відходи.
Наприкінці 1980-х один із нас (Смадар Коен) працював з Робертом Лангером, піонером у тканинній інженерії, в Массачусетському технологічному інституті. На той час ідея виготовлення живої тканини ще була мрією. За 20 років було вивчено багато матеріалів (синтетичних та природних), що сприяють зростанню клітин у функціональну тканину.
Розкладаються поліефіри є одними з найбільш широко використовуваних синтетичних матеріалів, але вони мають кілька недоліків. Вони гідрофобні, тому живі клітини погано прилипають до них, і каркаси, виготовлені з цими полімерами, як правило, розпадаються, а не руйнуються зі звичайною швидкістю. Кислі побічні продукти їх деградації викликають місцеве запалення тканин і загрожують виживанню пересаджених клітин. Нові синтетичні гідрогелі не мають цих недоліків, і їх текстура нагадує структуру природного позаклітинного матриксу, але їм бракує білків природного позаклітинного матриксу, наприклад колагену, які є важливими для правильного функціонування клітин.
Сам колаген, а також інші білки позаклітинного матриксу, такі як фібронектин, також були перевірені як носій. Хоча ці білки містять амінокислоти, яких живі клітини дотримуються, вони не мають достатньої механічної міцності для підтримки великої кількості клітин, і більше того, колаген швидко споживається ферментами в організмі. Крім того, деякі білки можуть бути відкинуті імунною системою, що лише збільшить ризик для пацієнта.
Тому ми вирішили виготовити каркас, виготовлений з альгінату, полісахариду, отриманого з водоростей. Він біосумісний, тобто імунна система не відкидає його. І коли деякі альгінати розчиняються у воді, а потім піддаються дії позитивно заряджених іонів кальцію, вони поводяться як гідрогель, що містить 98 відсотків води: їх консистенція драглиста і вони мають пружні властивості, подібні властивостям природного позаклітинного матриксу.
Однак, щоб використовувати цей альгінатний гідрогель як носій, нам потрібно було надати йому форму та внутрішню структуру, одночасно посиливши його механічну міцність, щоб він міг зберегти форму, незважаючи на вагу клітин, які його колонізували. Для цього ми розливали розчин альгінату в ряд форм, а потім охолоджували їх, використовуючи три методи, які давали чіткі градієнти температури під час заморожування. Кристали льоду, відокремлені тонкими стінками альгінату, що утворюються у всіх зразках. Після видалення цих кристалів сублімацією у нас залишився губкоподібний каркас, крихітні пори якого відображали форму кристалів. Діючи на параметри замерзання, ми змінили щільність пір, їх розмір і напрямок, а також щільність з'єднань (див. Рамку на сторінках 80 і 81).
Пори повинні бути взаємопов’язані, оскільки це дозволяє засіяним клітинам потрапляти в каркас. Також необхідно, щоб поживні речовини могли надходити до клітин і щоб їхні відходи усувалися. Ступінь взаємозв’язку пор також впливає на реваскуляризацію трансплантованої тканини. Нарешті, архітектура такого каркасу, який схожий на мох чи вулик, сприяє його механічній стійкості. Хоча вони в основному порожні (вони містять 95 відсотків пір), ці структури дуже міцні. Таким чином, у нас був каркас, який мав бажану структуру, не активуючи імунну систему, не токсичний, мав добру тривалу механічну стійкість і розпадався в організмі за розумний час. Ще потрібно було перевірити, чи живі клітини колонізували цю опору.
Перед імплантацією цих каркасів лабораторним тваринам ми спостерігали поведінку серцевих клітин на альгінаті in vitro. Ми взяли клітини серця ембріонів щурів, які, на відміну від зрілих кардіоміоцитів, ділитися, і суспендували їх у рідкому середовищі, що містить поживні речовини. Потім ми помістили в цю культуру середні круглі рамки діаметром шість міліметрів і товщиною в один міліметр. На вузол діяла помірна відцентрова сила; ми виявили, що клітини розподіляються в порах каркасів менш ніж за 30 хвилин. Швидкість є цінною перевагою у збереженні життєздатності цих чутливих до кисню клітин. Отже, ми змогли розмістити клітини високої щільності на наших опорах (10 8 клітин на кубічний сантиметр, щільність порівнянна з щільністю серцевого м’яза зрілого).
Відновіть фрагмент серця
Перед тим, як виконувати трансплантацію, ми ультразвуково вимірювали серцеву функцію щурів, роблячи те ж саме для групи контрольних щурів, які перенесли інфаркт та мали грудний отвір, але трансплантації не було. Через два місяці ми знову обстежили всіх щурів за допомогою УЗД серця. У контрольній групі ми спостерігали звичайний сценарій деградації серця: розширення лівого шлуночка та помітне зниження серцевої функції. Навпаки, у трансплантованих щурів розмір лівого шлуночка, товщина стінки та робота серця були стабільними.
Таким чином, ми запобігли будь-яке подальше погіршення, яке може призвести до серцевої недостатності. Однак ми все ще не знаємо механізму, за допомогою якого це лікування захищало серцевий м’яз, оскільки пересаджена тканина ще не сприяла скороченню серця. Здається, запобігаючи розростанню інфаркту та штучно потовщуючи стінку серця в зоні інфаркту, трансплантат запобігав звичайному перебудові шлуночка.
Ми вважаємо, що ріст нових судин в області інфаркту також сприяв уповільненню погіршення стану тканин. Кількість і розмір нових кровоносних судин збільшувались, коли ми імплантували носії, заселені клітинами, але ми виявили, що навіть носії без клітин стимулюють ріст нових судин при серцевому нападі.
Можливо, альгінатний каркас стимулює ріст судин просто тому, що він забезпечує їх підтримку, коли вони потрапляють у пошкоджену ділянку. Сам матеріал повинен залучати стовбурові клітини, які стимулюють регенерацію, оскільки молекулярна структура альгінату нагадує структуру одного з основних полісахаридів природного позаклітинного матриксу. Щоб перевірити цю гіпотезу, нещодавно ми ввели альгінатний гідрогель безпосередньо в інфаркти щурів. Навіть у цій формі альгінат зберігав структуру та функції шлуночка, мабуть, виступаючи замінником позаклітинного матриксу та стимулюючим ангіогенез.
Ми працюємо над виявленням потенційних джерел серцевих клітин, які можуть бути використані при трансплантації людині. Зрілі клітини серця пацієнта не реплікуються і не можуть використовуватися для відновлення інфаркту. Клітини потенційних донорів, які можуть стати кардіоміоцитами, включають ембріональні стовбурові клітини та дорослі стовбурові клітини кісткового мозку або пуповинної крові. Усі ці клітини-донори імунна система пацієнта визнає чужорідними, що вимагає використання імунодепресивних препаратів. Аутологічні клітини - від самого пацієнта - було б кращим, щоб уникнути цієї труднощі. Це можуть бути стовбурові клітини та клітини-попередники, отримані з кісткового мозку, м’язів або жиру, або ембріональні стовбурові клітини, вироблені з клітин пацієнта шляхом терапевтичного клонування. Або стовбурові клітини серця, але ми їх ще не ідентифікували.
Наші результати пропонують кілька можливих підходів до застосування альгінатних носіїв для захисту та регенерації людських сердець, пошкоджених інфарктом міокарда. Наприклад, ми переконані, що протягом трьох років ми будемо готові протестувати ненасіння насіння альгінату у пацієнтів, які перенесли інфаркт міокарда. Наші нещодавні експерименти на свинях підтвердили те, що ми спостерігали на щурах: навіть без клітин альгінатний носій запобігає розширенню серцевого нападу та перешкоджає перебудові шлуночкової стінки.
Ця здатність альгінату сприяти розвитку ангіогенезу свідчить про те, що ми можемо покращити виживання трансплантованих клітин, спочатку імплантуючи каркас, чекаючи васкуляризації, а потім засіваючи каркас клітинами. Ми протестували метод на щурах, маючи багатообіцяючі результати. Судинність також суттєво посилилася, коли ми включили мікросфери в структуру, яка регульовано вивільняла фактори росту. На жаль, попередня васкуляризація каркасу зменшує простір для трансплантованих клітин, і ми досліджуємо, як скорегувати ангіогенез, використовуючи різні типи факторів росту.
Сьогодні ми знаємо, як контролювати форму, склад та функції серцевої тканини in vitro. Пацієнтам, які перенесли інфаркт міокарда, потрібно було б замінити шматочок серця, а імплантації порожньої пористої опори було б недостатньо. Тому ми стикаємося з проблемою збереження трансплантованої тканини в живих до відновлення місцевих судин. Сьогодні ми прагнемо виготовити попередньо васкуляризований трансплантат.
Ми створили капілярне русло in vitro, засіявши альгінатну опору ендотеліальними клітинами, які нормально вистилають стінки судин, а потім культивували цю структуру в біореакторі. На наступному етапі ми будемо культивувати разом на каркасі ендотеліальні клітини та кардіоміоцити, щоб спробувати виростити капіляри всередині фрагмента міокарда. Навіть якщо ми досягнемо успіху, нам доведеться перевірити, чи це капілярне русло стає функціональним після трансплантації та з якою швидкістю. Якщо зв’язки з місцевими судинами швидко встановити, то шанси на виживання пересадженої тканини будуть чудовими.
Багато дослідників намагаються створити попередньо васкуляризовану тканину, використовуючи різноманітні стратегії. Об'єднання отриманих результатів неминуче сприятиме цьому бурхливому розвитку інженерії серцевої тканини. Це займе десятиліття, якщо не два, але виготовлення шматочка живого людського серця - це вже не утопія.