Виявлення геному метапневмовірусу людини (hmpv) у госпіталізованих дітей - Безкоштовний PDF

Виявлення геному метапневмовірусу людини (hmpv) у госпіталізованих дітей Інавгураційна дисертація на здобуття докторської ступеня вищого медичного факультету Рейнського університету імені Фрідріха-Вільгельма-Бонна Томаса Бернда Глатцеля з Бонна 2008

геному

Підготовлено з дозволу медичного факультету Боннського університету 1. Рецензент: Dipl.-Biol. Прив.-доз. Лікар. вип. нац. Олівер Шильдген 2-й рецензент: проф. мед. Юрген Рокстрох День усного іспиту: 27 жовтня 2008 р. Від Інституту медичної мікробіології, імунології та паразитології ім.Рейніше Фрідріха-Вільгельмса-Університету Бонн Директор: проф. мед. Публікація Ахіма Горауфа: Ця дисертація опублікована в електронному вигляді на університетському сервері публікацій ULB http://hss.ulb.uni-bonn.de/diss_online.

Зміст 0 Список скорочень 7 1 Вступ 9 1.1 Параміксовіруси 9 1.1.1 Класифікація 10 1.1.2 Структура 12 1.1.2.1 Частинки вірусу 12 1.1.2.2 Геном і структура геному 12 1.1.2.3 Вірусні білки 14 1.1.3 Реплікація 16 1.1.4 Віруси парагрипу 17 1.1.5 Вірус епідемічного паротиту 19 1.1.6 Вірус кору 20 1.1.7 Респіраторно-синцитіальний вірус (RSV) 23 1.1.8 Метапневмовірус людини (hmpv) 25 1.2 Мета роботи 29 2 Матеріал і методи 30 2.1 Матеріал 30 2.1.1 Обладнання 30 2.1.2 Хімічні речовини 31 2.1 .3 Середовище 32 2.1.4 Культури клітин 33 2.1.5 Розчинні речовини 33 2.1.6 Буфери 34 2.1.7 Швидкі тести 34 2.1.8 Реагентні системи 35 2.1.9 Ферменти 35 2.1.10 Нуклеотиди 35 2.1.11 Праймери 35 2.1.12 Стандарт розміру ДНК 36 5

2.1.13 Плазміди 36 2.1.14 Зразки 36 2.2 Методи 37 2.2.1 Культура клітин 37 2.2.2 Екстракція РНК з супернатанту культури клітин за допомогою міні-набору RNeasy Protect 38 2.2.3 Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) 40 2.2.4 Гель-електрофорез 45 2.2.5 Очищення Ампліфікація ПЛР за допомогою набору для очищення QIAquick-PCR 46 2.2.6 Клонування ампліфікації ПЛР за допомогою набору для клонування TOPO TA 47 2.2.7 Послідовність рекомбінантних плазмід 50 3 Результати 52 3.1 РНК-пізній буфер 52 3.2 Культура клітин 53 3.3 Оптимізація ПЛР 53 3.4 інфекції hmpv та RSV 54 3.5 Розподіл за віком 55 3.6 Сезонний перебіг 56 3.7 Симптоми та діагностика 57 3.8 Коінфекції 57 3.9 Випадки 58 3.10 ВПЛ та середній отит 65 4 Обговорення 67 5 Резюме 71 6 Бібліографія 72 7 Подяки 88 6

0 Список скорочень: APV Пташиний пневмовірус CMV CPE CRP CT Вірус цитомегалії Цитопатичний ефект С-реактивний білок Обчислювана томограма ДНК dntps Дезоксирибонуклеїнова кислота Дезоксирибонуклеозид трифосфат E. coli Escherichia coli EDTA Етилендіамін тетрауксусна кислота ЕГЕ Ензим енцетат кислота Ецемент Ецемент Ецемент Ецемент Ецемент Ецемент Ецемент Ецемент Ецемент Ецемент Ецемент Ецемент Ецемент Ецетна кислота ЕГК ЕГК ЕГЕ Ензим Ецетат Ецетат Ецетат Ецетат Ецетат Ецетат кислоти Ец. та інші FCS Фетальна теляча сироватка GCS Глазго кома шкала HBV HCV HHV hmpv HSV Гепатит В Вірус Гепатит С Вірус Вірус герпесу людини Вірус людини Метапневмовірус Вірус простого герпесу kb kd Кілобази Кілодалтон 7

LB мм mrna MRT Лурія-Бертані Мілімолярний вісник-рибонуклеїнова кислота Магнітно-резонансна томограма ND nm NS не виконується Нанометр Неструктурний білок PBS ПЛР Фосфатно-сольовий розчин Полімеразна ланцюгова реакція SDS SSPE Натрію додецилсульфат підгострий склерозуючий паненцефаліт вірус РНК rvgvmvto RSVM rvg.

Параміксовіруси характеризуються наступними п’ятьма властивостями: 1. Вони мають негативно орієнтовану одноланцюгову РНК, яка міститься виключно в стійкій до РНК гвинтоподібній нуклеокапсиді, яка також містить вірусну полімеразу. 2. Транскрипція здійснюється в типовому режимі зупинки-перезапуску. 3. Вірусна реплікація відбувається в цитоплазмі. 4. Частинки вірусу потребують ліпідної оболонки на клітинах-мішенях, щоб зв’язатись там. 5. Вірус проникає в клітину шляхом злиття мембрани вірусу з клітинною мембраною (Collins et al., 2001) 1.1.1 Класифікація Параміксовіруси класифікуються на дві підсімейства: параміксо- та пневмовірина. Подальший поділ на роди та деякі характерні представники наведено в таблиці 1. 10

Підсімейство Рід людських тварин Paramyxovirinae Respirovirus Parainfluenzavirus Types 1 and 3 Bovin Parainfluenza Virus Type 3, Sendaivirus Rubulavirus Mumps Virus, Parainfluenza Virus Types 2 and 4a, b Canine Parainfluenza Virus Type 2, Avulavirus virus virus newcastle virus virus -Petits- Віруси жуйних-Вірус геніпавірусу Хендравірус Ніпахвірус Хендра Ніпа Menangle Pneumovirinae Пневмовірусний респіраторний бичачий синцитіальний вірус (RS-респіраторний вірус) Синциціальний вірус, Пневмонія-вірус мишачого метапневмовірусу Вірус людського ринотрахеїту АР Міжнародним комітетом таксономії вірусів у 2000 р. 11

2 Матеріал та методи 2.1 Матеріал 2.1.1 Обладнання інкубатора: Інкубатор із газом CO, Heraeus, Hanau Incubator C200, Labotect, Меккенхаймські електрофорезні камери: Модель B1, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Model 41-1825, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen Schüller: Certomat S, Sartorius BBI Systems International GmbH Гойдалка, Biometra GmbH, Göttingen Sequencer: 3130 Генетичний аналізатор, Прикладні біосистеми, Дармштадтські пристрої напруги: Модель блоку живлення 500/200, Лабораторії Bio-Rad, Модель живлення Мюнхена 250/2.5, Лабораторії Bio-Rad, Мюнхенські стерильні стенди: Herasafe, Heraeus Instruments, Hanau STERIL-ANTARES, Biohit Deutschland GmbH, Rosbach Thermocycler: Mastercycler gradient, Eppendorf, Hamburg T3 Thermocycler, Biometra GmbH, Göttingen Vortexer: Vortex-Genie2, Fisterher-Genie2, Fisherher-Genie2: PM 1200, Mettler Toldedo GmbH, Швейцарія Водяна баня: GFL 1038, Gesellschaft für Labortechnik mbh, Центрифуги Burgwedel: Biofuge 13, Heraeus Instruments, Hanau Cent rifuge 5415 C/5417 C, Eppendorf AG, Hamburg Megafuge 1.0, Heraeus Instruments, Hanau MULTIFUGE L-R, Heraeus Instruments, Hanau TDX Centrifuge TM, Abbott Diagnostica, Wiesbaden UJ II KS, Heraeus Instruments, Hanau 30

2.1.2 Хімічні речовини Компанії, хімічні речовини яких використовувались: Агароза Ампува Бакто-Агар Бакто-Триптон Бакто Дріжджовий Екстракт Борна Кислота Бромофенол Блакитний Орел s-мінімум Ефірна Середня ЕДТА Етанол Етідій бромід Фетальна теляча сироватка Калій хлорид Калій гідроген фосфат Натрій хлорид ди-натрію гідрофосфат гідрохлорид фосфат хлорид фосфат гідрохлорид фосфат гідрохлорид фосфат хлорид фосфат хлористий Розчин трипсину/ЕДТА SeaPlaque GTG Agarose, Cambrex Bio Science Rockland, Inc.; Biozym Seakem LE Agarose, Biozym, Oldendorf NuSieve GTG Agarose, Biozym, Oldendorf Fresenius Kabi, Bad Homburg Difco, Detroit, USA Difco, Detroit, USA Difco, Detroit, USA Merck KGaA, Darmstadt Serva, Heidelberg MerchGG Merchadt Merch, AG KGaA Darmstadt Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim Biochrom, Berlin Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Merck KGaA, Darmstadt Biochrom AG, Berlin 31

2.1.3 Середовище Eagle s Minimal Essential Medium Eagle s-mem-earle NaHCO 3 Додавання: Глютамін Пеніцилін G Стрептоміцин Фетальна теляча сироватка Biochrom AG, Берлін 2,2 г/л 280 мкг/л 40 Од/мл 50 мкг/л 10% (v/v) середовище Luria Bertani (середовище LB) з екстрактом дріжджів ампіциліну Бакто 2,5 г Бакто-триптону 5 г NaCl 2,5 г Аква дест. до 500 мл. Цю суміш автоклавували протягом 20 хвилин, зберігали в холодильнику при 4 ° С і до інокуляції додавали 50 мкг ампіциліну. Агарові пластинки Luria Bertani (пластинки агару LB) з екстрактом дріжджів ампіциліну Бакто 2,5 г Бапто триптону 5 г NaCl 2,5 г Багато агару 6,25 г дистильованої води. до 500 мл Цю суміш автоклавували протягом 20 хвилин, після охолодження середовища додавали 50 мкг ампіциліну і 20-30 мл кожного поміщали в чашку Петрі (Ø: 10 см), а потім зберігали при 4 С у холодильнику. 32

SOC середовище (6 мл) триптону 2% дріжджовий екстракт 0,5% NaCl 10 мм KCl 2,5 мм MgCl 2 10 мм MgSO 4 10 мм глюкози 20 мм 2.1.4 Культури клітин Vero-B4 клітини ATCC-ACC-33 LLC -Клітини MK2 ATCC-CCL7 Клітини MS, не перелічені ATCC клітини MDCK ATCC-CLL-34 RD клітини A-204; ATCC-ACC-250 2.1.5 Основні розчини Ампіцилін 50 мг/мл (H 2 O) EDTA (0,5 M) EDTA Aqua dest. титрують до рН 8 за допомогою NaOH, автоклавують 186,1 г на 1000 мл броміду етидію 10 мг/мл 33

Фосфатно-сольовий сольовий розчин (PBS) NaCl KCl Na 2 HPO 4 KH 2 PO 4 Aqua dest. pH титрують до 7,4 за допомогою HCl, автоклавують 8 г 0,2 г 1,44 г 0,24 г і 1000 мл 2,1.6 Буфер Трис-борат-EDTA-буфер (TBE-буфер 5x) Трис-основна борна кислота EDTA ( 0,5M) H 2 O 54 g 27,5 g 20 ml ad 1000 ml 2.1.7 Швидкі тести Швидкий тест RSV Тест на швидкий тест на грип Тест RSV, Directigen, Sparks USA Flu A + B test kit, Directigen, Sparks USA Використання цих швидких тестів кожну пробу, отриману від пацієнтів з інфекцією верхніх та нижніх дихальних шляхів, тестували на грип та RSV. Результати цих випробувань були включені до розділу результатів цієї роботи. 34

2.1.8 Реагентні системи BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems, Foster City USA Розширити систему високої точності ПЛР Roche Diagnostics GmbH, Mannheim HiSpeed ​​Midi Qiagen GmbH, Hilden, HiSpeed ​​Maxi Qiagen GmbH, Hilden, Німеччина One Step RT-PCR Kit Qiagen GmbH, Hilden, Німеччина QIAprep Spin Miniprep Qiagen GmbH, Hilden, Німеччина QIAquick-PCR-Purification Kit Qiagen GmbH, Hilden, Germany RNeasy Protect Mini Kit Qiagen GmbH, Hilden, Germany Topo-TA Cloning Kit Invitrogen GmbH, Карлсруе, Німеччина 2.1.9 Фермент-ферментні ферменти EcoR1 Biolabs, Schwalbach, Німеччина ДНК-полімераза Thermus aquaticus ДНК-полімераза Roche Applied Science, Мангейм, Німеччина Thermus aquaticus ДНК-полімераза Qiagen GmbH, Hilden, Німеччина Зворотна транскриптаза Omniscript, Sensiskript Зворотна транскриптаза Qiagen GmbH, Hilden, Німеччина 2.1.10 Нуклеотиди триоксиспаденозазин 25 нм) дезокситимідин трифосфат (25 нм) дезоксицитозин трифосфат (25 нм) дезоксигуанозин відключення фосфат (25 нм) Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Німеччина 2.1.11 Грунтовки Чотири праймери засновані на публікації Viazov et al. (2003) взято. Тому їх послідовності відповідають області гена N. 35

Всі грунтовки, що використовувались для цієї роботи, були виготовлені Sigma, Deisenhoven. Послідовності, які тепер слідують, зазначаються у напрямку 5 3. 111s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGAG 705as TGCTTTGCTGCCTGTAGATGATGAG 114s AGAGTCTCAGTACACAATMAAAAGRGATG 442as GCCATTGTTTTYCTTGCYTC 2.1.12 Стандарт довжини ДНК 1Kb Плюс ДНК-Маркер, Маннхайм університетської дитячої лікарні Бонн з 1 жовтня 2001 року по 31 березня 2004 року 1 жовтня 2001 року 30 вересня 2002 року n = 5 (не включено в дослідження) 1 жовтня 2002 року 31 березня 2003 року n = 300 1 жовтня 2003 року 31 березня 2004 року n = 332 n всього = 632 36

Цільова послідовність 1. Поділ ланцюга нагріванням до 95 C 2. Гібридизація з праймерами охолодженням до 54 C 3. Синтез ДНК шляхом розширення праймерів при 72 C Рисунок 2 Цикл ПЛР Для множення цільової послідовності - тут забарвленого в синій колір - ДНК Подвійна спіраль розплавилася у дві одинарні нитки нагріванням до 95 ° C. Для того, щоб мати можливість ініціювати синтез ДНК, спочатку повинні приєднатися праймери, комплементарні цільовій послідовності. Це відбувається, коли реакційну суміш охолоджують до 54 С. Потім, починаючи з праймерів, ДНК-полімераза синтезує комплементарні ланцюги до одиничних ланцюгів вихідної ДНК. Цей етап реакції відбувається при 72 С. Ці етапи повторюються кілька разів, і кількість ДНК збільшується в геометричній прогресії. 41

Вкладена ПЛР Вкладена ПЛР слідує класичній ПЛР. Після того, як був відтворений більший зріз ДНК, що містить цільову ДНК, цей розділ використовується як шаблон для вкладеного ПЛР, у якому реплікується менший зріз, який також містить цільову ДНК (див. Рис. 3.2). Ця процедура дозволяє підвищити чутливість та специфічність ПЛР. У цій роботі для вкладеної ПЛР була використана система ПЛР Roche Expand High Fidelity. Праймер першого раунду Ціль-ДНК Праймер першого раунду Праймер першого раунду Перша розшифровка Праймер другого раунду Специфічний амплікон цільової ДНК Рисунок 3 Вкладений ПЛР У верхньому розділі малюнка показано ПЛР (див. Вище). У другому розділі показано фактично вкладену ПЛР. Праймери, позначені праймерами другого раунду, є праймерами вкладеної ПЛР. Вони ближчі до цільової ДНК, ніж первинні праймери. Конкретні сегменти ДНК тут також ампліфікують за допомогою етапів реакції, як описано вище для ПЛР. 42

52 C 30 секунд відпалу 72 C 1 хв подовження Після цих циклів термінальне подовження проводили при 72 C протягом 5 хвилин. Після завершення цього процесу партії зберігали при 4 С до подальшого використання. Партія реакцій вкладеної ПЛР для hmpv Для вкладеної ПЛР була використана розширена система ПЛР з високою вірністю від Рош, Мангейм. 10-кратний буфер для ПЛР 5 мкл dntps (100 мм) 3 мкл ферментної суміші 1 мкл праймера 114s (25 пмоль/мкл) 0,5 мкл 442as праймера (25 пмоль/мкл) 0,5 мкл MgCl 2 (25 мм) 1 мкл Без РНКази вода 34 мкл шаблон 5 мкл 50 мкл протокол вкладеного ПЛР Після початкової денатурації при 94 ° C протягом 2 хвилин наступний цикл проводився 40 разів: 94 ° C 30 секунд денатурація 53 ° 30 секунд відпал 72 ° 45 секунд подовження. За цим слідував інший термінал Подовження при 72 ° C протягом 5 хвилин і зберігання як у циклері, так і в холодильнику при 4 ° C. Серія розведення для оптимізації вкладеної ПЛР з додаванням магнію На відміну від такої, проведеної Viazov et al. (2003), запропонований протокол ПЛР, магній був доданий до вкладеного ПЛР для стабілізації в цій роботі. 44

35,00% 30,00% 25,00% 20,00% 15,00% 10,00% 5,00% 0,00% 30,40% 26,70% 28,60% 22% 18% 13. 70% 4,30% 3,60% 3,95% 2002/2003 сезон сезон 2003/2004 сезон загальний hmpv RSV hmpv + rsv Таблиця 6 Відсоток частки RSV та hmpv або подвійних інфекцій з періодів 01.10.2002 до 31.03. 2003 (сезон 2002/2003), з 1 жовтня 2003 року по 31 березня 2004 року (сезон 2003/2004) та за весь період (загалом), виходячи із загальної сукупності 300 або 332 пацієнтів із зазначених періодів. 3.5 Віковий розподіл Віковий розподіл інфекцій з hmpv призвів до наступного розподілу: новонароджені (вік 4 тижні) n = 0 (0%), 5 тижнів-5 місяців n = 16 (14.03%), 6-12 місяців n = 20 ( 17,54%), 13-24 місяці n = 21 (18,42%),> 24 місяці n = 31 (27,19%). Отже, більше половини хворих на ВІЛ-інфекцію були старше 12 місяців, а більше третини пацієнтів - старше 24 місяців. Вік невідомий у 26 пацієнтів (22,8%). Віковий розподіл даних наведено в таблиці 7. 55

22,80% 27,19% 0% 14,03% 18,42% 17,54% до 4 тижнів 5 тижнів - 5 місяців 6-12 місяців 13-24 місяців протягом 24 місяців невідомо Таблиця 7 Відсотковий розподіл за віком пацієнтів з ВГВ -інфекція в період з 1 жовтня 2002 року по 31 березня 2004 року. 3.6 Сезонний перебіг. Зображення, наведене в таблиці 8, призвело до сезонного розподілу інфекцій з hmpv. Немає чіткого сезонного накопичення на рубежі 2002/2003 років, тоді як у сезоні 2003/2004 був чіткий максимум у січні. 30 25 20 15 10 5 0 hmpv 02/03 hmpv 03/04 жовтень листопад грудень січень лютий березень квітень Таблиця 8 Сезонна тенденція кількості випадків хвороби hmpv у зимові періоди 2002/2003 та 2003/2004 56

A Рисунок 9 B Зважене за допомогою T1 осьове МРТ-зображення (A), корональний FLAIR (відновлення інверсії, що ослаблене рідиною) (B) 14-місячного пацієнта з ознаками hmpv. Значне збільшення сигналу кортикальної та підкіркової; трактується як ураження в контексті енцефаліту (Schildgen et al. 2005). Надано радіологічною клінікою Боннського університету. Фіг.10 КТ-зображення того самого пацієнта через 2 дні після МРТ. Зони гіподензи; інтерпретується як ознака загального набряку мозку (пульпи та кори). Накопичення гіперденсу в павутинному просторі, чого на МРТ ще не було (Schildgen et al. 2005). Надано Радіологічною клінікою Боннського університету 61