Вінілхлорид та дієта з високим вмістом жиру як модель протоколу взаємодії навколишнього середовища та ожиріння
Резюме
Метою цього протоколу було розробити мишачу модель токсичного впливу з низьким рівнем, яка не спричиняє явної травми печінки, а посилює вже існуючі пошкодження печінки. Ця парадигма краще рекапітулює вплив людини та незначні зміни, що відбуваються під впливом токсичних концентрацій, які вважаються безпечними.
Анотація
Хлорид вінілу (VC), рясний забруднювач навколишнього середовища, викликає високий рівень стеатогепатиту, але вважається безпечним при менших концентраціях. Хоча кілька досліджень вивчали роль ВК як безпосереднього гепатотоксичного агента, концепція, згідно з якою ВК підвищує чутливість печінки до інших факторів, таких як безалкогольна жирова печінка (НАЖХП), спричинена дієтами з високим вмістом жиру (ХФД), є новою. Цей протокол описує парадигму впливу для оцінки наслідків хронічного, низького впливу ВК. Мишей вакцинують на дієті з низьким вмістом жиру або з високим вмістом жиру протягом одного тижня до початку інгаляційного впливу і залишаються на цій дієті протягом усього експерименту. Миші - VC (рівень під OSHA:
Вступ
Основним шляхом впливу багатьох токсинів та забруднювачів навколишнього середовища є вдихання. Після інгаляції сполука може потрапляти в системний кровообіг через легені, потрапляти в печінку та метаболічно активуватися печінковими ферментами до виведення 14, 15, 16. Часто саме ці активні метаболіти викликають токсичність та пошкодження організму. Попередні дослідження цієї групи та інших використовували метаболіти ВК як замінники впливу газу ВК 17, 18. Інші групи використовували інгаляційні моделі ВК; однак були застосовані надзвичайно високі рівні впливу (> 50 ppm) для індукування гострої токсичності, важкого ураження печінки та розвитку пухлини 19. Хоча ці дослідження надали важливу інформацію та механізми ВК-індукованої канцерогенності, вони не повторюють тонких ефектів та складних взаємодій з іншими факторами, що сприяють цьому, і, отже, менш важливі для впливу людини.
Описана тут модель інгаляції ВК та високожирна їжа (HFD) (див. Малюнок 1 для часової шкали) - це перша модель хронічного впливу низьких доз ВК (тобто концентрація суб-OSHA), при якій миші піддаються дії токсину в умовах, які набагато ближче імітують вплив людини. Дійсно, дані цієї моделі підсумовують результати, що спостерігаються у людей з ВК, такі як вплив на метаболічні шляхи 20, окислювальний стрес та дисфункція мітохондрій 4. Інші моделі вдихання миші, такі як B. Моделі голови та носа 21 вимагають, щоб тварина було приборкано, що створює стрес у тварини. Тут цей метод впливу на все тіло не вимагає ніяких ін’єкцій або зайвого стресу для тварин. Тварини мають вільний доступ до їжі та води і їх розміщують у більшій інгаляційній камері на певну кількість годин на день та день на тиждень. Крім того, концепція про те, що ВК змінює чутливість до іншого гепатотоксичного агента, є новою знахідкою, вперше виявленою цією Групою 12, і впливає на вплив ВК при концентраціях, значно нижчих від концентрацій прямої гепатотоксичності. необхідні.
Цей метод інгаляційного впливу може бути використаний для імітації впливу різноманітних газоподібних токсинів, включаючи інші леткі органічні сполуки, у нашому середовищі. Дійсно, леткі органічні сполуки є великою групою забруднювачів навколишнього середовища і є більш поширеними в промислово розвинутих районах, ставлячи певні популяції до більшого ризику хронічного впливу 22. Цей протокол можна адаптувати до різних експериментальних питань. Тривалість і концентрація введеного з'єднання можуть бути різними. Незважаючи на те, що спочатку він був розроблений для визначення пошкодження печінки, інші системи органів могли і були вивчені за допомогою цієї моделі 23. Дослідники, які вивчають хронічний вплив тварин, але бажаючи мінімізувати стрес у тварин, повинні розглянути цю модель.
Протокол
Усі експерименти на тваринах/ВК були схвалені Департаментом охорони навколишнього середовища, Асоціацією безпеки для оцінки та акредитації лабораторних доглядів за тваринами, а процедури затверджені місцевим Інституційним комітетом з догляду та використання тварин.
1. Експериментальна установка та акліматизація до очищених експериментальних дієт
ПРИМІТКА. Існує кілька систем впливу на вдихання, котрі доступні від експозиції лише на ніс до експозиції всього тіла та від ручних до автоматизованих систем. Дані, опубліковані раніше цією групою, були отримані з цілісної ручної системи 12, 23, 24. Малюнок 2На рисунку 3 представлена схема, що описує автоматизовану систему впливу на вдихання.
4. Клітка для опромінення та підготовка тварин
- Вийміть мишей із їхніх житлових камер і помістіть їх в окремі клітини клітини інгаляційної камери (одна опора клітини для контрольних мишей, друга для мишей, що зазнали впливу). Щоденно рандомізуйте розміщення кожної миші в клітці, щоб гарантувати, що кожна миша буде однорідно оголена в експозиційній камері. Позначте в лабораторному зошиті кількість і місце клітини кожної тварини.
- Помістіть кожну стійку клітки у відповідну камеру та закрийте дверцята камери.
5. Проведення експозиції
- Поверніть кран на клапані для газового бака VC у закрите положення та перекрийте всі потоки повітря в експозиційній камері. Повертайте ротаметр, доки через камеру управління не буде протікати повітря.
- Зніміть дверцята з кожної камери, щоб провітрити мишей. Зніміть опори клітки з камер. Вийміть мишей з капюшоном із їхніх клітин для опромінення та розмістіть їх у своїх клітках. Транспортуйте всіх мишей назад у свої житлові приміщення для ночівлі в звичайних клітках.
- Утилізуйте всі відходи зі сміттєпроводу у затверджений Міністерством охорони навколишнього середовища та безпеки (DEHS) контейнер для біологічної небезпеки, оскільки його можуть вважати хімічною небезпекою інституційні служби охорони навколишнього середовища. Очистіть дверцята камери, лоток для виведення, клітку для опромінення та експозиційну камеру для експериментальної та контрольної систем.
7. Перевірка концентрації ВК в камерах під час впливу
8. Припинення експерименту з інгаляційним впливом
ПРИМІТКА: Відповідно до бажаного часу впливу, напр. B. Через 6, 8 та/або 12 тижнів після початку вдихання, експерименти закінчуються і тварини піддаються евтаназії (див. Малюнок 1 для часової шкали).
Репрезентативні результати
В ході експерименту щотижня контролювали масу тіла тварини та споживання їжі для забезпечення здоров’я тварин та оцінки метаболізму in vivo. Малюнок 3А. показує масу тіла та споживання їжі для 12-тижневого експерименту. Вагу тіла вимірювали раз на тиждень, а споживання їжі двічі на тиждень для всіх груп. Усі миші набирали вагу протягом дослідження. У той час як миші в групах HFD набирали більше ваги, ніж миші в групах LFD, як і очікувалося, миші, що зазнали впливу ВК, не набирали більше ваги, ніж миші у відповідній контрольній групі. Споживання їжі не відрізнялося у всіх групах 12, 24.
Малюнок 3B. показані репрезентативні фотомікроскопи зрізів печінки, пофарбованих H&E для аналізу загальної морфології. У групі LFD ВК не викликав жодних патологічних змін. Харчування HFD суттєво збільшувало стеатоз (накопичення жиру) та вплив ВК збільшували цей ефект. Крім того, вплив ВК викликав деякі запальні точки в групі HFD 12, 24 .
Рівні трансаміназ у плазмі крові (ALT та AST) вимірювали як показники пошкодження печінки, а підвищений рівень трансаміназ - показник ураження печінки. У групі LFD трансамінази не збільшувались з VC. Лише HFD незначно підвищував рівень трансаміназ і, перш за все, ВК значно покращує цей ефект (рис.3C.) 12, 24 .
Для кожної групи розраховували співвідношення маси печінки та маси тіла. HFD значно збільшив співвідношення печінки до маси тіла. Однак ВК не суттєво посилив цей ефект (рис.3Д.) 12 .
Обговорення
Ця модель VF-посиленого NAFLD є новим методом для оцінки ефекту порогового впливу ВК під суб-OSHA в парадигмі інгаляції всього тіла. Ця модель дозволяє дослідникам вивчати субгепатотоксичні та сенсибілізуючі ефекти лише від низьких рівнів ВК. Насправді, ця модель спільного опромінення досягає поліпшення пошкодження печінки, підвищення рівня АЛТ та АСТ у плазмі крові та помірного запалення, хоча в значній мірі не впливає на інші системи органів, такі як серце, при цій концентрації. Ця хронічна модель вимагає інгаляційних камер для всього тіла, але мінімізує рівень стресу та впливу. Хоча представлений тут протокол є програмним підходом, наш досвід показав, що ручний підхід - це також точний і послідовний метод впливу 12, 24. Крім того, він легко застосовується до кількох дослідницьких областей, включаючи інші пошкодження органів 23, спричинені впливом летких органічних сполук 22. Зокрема, ця модель може більше нагадувати патогенез спільного впливу людини хімічними речовинами навколишнього середовища та основного захворювання 5 .
Для досягнення подібних результатів необхідно досягти певних критичних етапів оптимізації протоколів. Наприклад, оцінювачі повинні визначити, що концентрація ВК або іншого токсичного агента в камерах знаходиться в межах бажаного діапазону експозиції (тобто, низький, суб-OSHA або гострий рівень). Оптимізація цього кроку інгаляційної камери є критично важливою для успішної моделі впливу на людські інтереси. По-друге, коригування часу експозиції на добу та тривалості експерименту також можна змінити. Відповідно до інтересів цієї групи було досягнуто встановлення професійного впливу та додатковий параметр харчування. Однак за допомогою цього протоколу також можна змоделювати екологічні та гострі впливи.
Ця робота кидає виклик парадигмі того, що нинішні межі впливу ВК (професійні та екологічні) є безпечними. Незважаючи на те, що нинішня межа експозиції OSHA для ВК становить 1 ppm, ця модель продемонструвала, що концентрації ВК нижче цієї межі є достатніми для полегшення травм печінки, спричинених HFD у мишей. Цей протокол дозволяє дослідникам вивчати та характеризувати нову парадигму токсичного впливу та моделювати TASH.
Це перша модель хронічного впливу низьких доз ВК. У попередній роботі використовувались дуже високі болюсні концентрації, гостра експозиція або активні метаболіти як замінники впливу ВК. Усі ці підходи зменшують відповідність висновків впливу людини. Отже, ця нова модель взаємодії TASH-NAFLD забезпечує необхідну платформу для дослідників для вивчення складних взаємодій при низькій експозиції ВК.
Ця модель токсичного ураження печінки може бути використана для інших летких органічних сполук, а також для вивчення інших взаємодій, які можуть впливати на печінку та інші системи органів 8, 22, 23. Крім того, ця модель використовувалась і може бути надалі використана для дослідження втручальних методів лікування та глибоких механістичних досліджень способу дії цього переважного токсичного агента 24. Оскільки ВК є відомим канцерогеном 26, 27, 28, ця парадигма впливу також може бути змінена для вивчення раку, викликаного ВК. Інші супутні захворювання, такі як алкогольна хвороба печінки, також можуть посилюватися при спільному впливі ВК. Крім того, було б цікаво вивчити різні типи жиру, такі як поліненасичені жирні кислоти 18, 29, 30 або різні типи вуглеводів 31, та їх спільний вплив на ВК в цій моделі. Насправді, як відомо, всі ці фактори мають різний вплив на розвиток пошкодження печінки і можуть відігравати певну роль у захворюваннях печінки, викликаних ВК.
Підводячи підсумок, це нова модель інгаляцій для екологічно токсичного ураження печінки та встановлює парадигму впливу для хронічного впливу з низьким рівнем ВК. Концентрація ВК, використана в цій моделі, сама по собі субгепатотоксична, в той час як вона покращує пошкодження печінки, спричинене іншим фактором (HFD) у мишей. Ця модель дозволить дослідникам дослідити механізми та втручання щодо хронічної токсичності ВК і може бути корисною для трансляційних досліджень, що вивчають людей, що піддаються впливу, які мають найбільший ризик впливу.
Розкриття інформації
WT Goldsmith має фінансовий інтерес до IEStechno, шаблону для описаної системи. Іншим авторам нічого розкривати.
Подяка
Це дослідження фінансувалося нагородами Національних інститутів охорони здоров’я (K01 DK096042 та R03 DK107912) Джуліані Беєр. Дослідження також було підтримано нагородою за інституційний розвиток (IDeA) від Національного інституту загальних медичних наук до Національного інституту охорони здоров’я під грантовим номером P20GM113226 та від Національного інституту зловживання алкоголем та алкоголізмом Національного інституту охорони здоров’я під номером премії P50AA024337. Вміст несе виключну відповідальність авторів і не обов’язково відображає офіційні погляди Національних інститутів охорони здоров’я.