Виробництво інсуліну
Цукровий діабет - це хвороба номер один у цивілізації. При I типі острівці Лангерганса руйнуються імунною системою. Цей тип зустрічається до 20 років. При типі II (діабет похилого віку), який зустрічається у більшості хворих на діабет, рівень інсуліну в крові є нормальним або підвищеним, але зміни в місці, де працює гормон, зменшать його функціональність.
Потреба в інсуліні надзвичайно висока. Використання генетично модифікованих бактерій полегшує охоплення сьогодні, ніж раніше. До використання бактерій інсулін отримували з підшлункової залози свиней або великої рогатої худоби. Діабетик використовував підшлункову залозу приблизно від 50 свиней для покриття щорічної потреби.
Що трапилось?
Це пояснює, які внутрішні клітинні процеси відбуваються в бета-клітинах, що призводять до активного інсуліну.
Як можна виробляти людський інсулін за допомогою бактерій.
Вироблення інсуліну в організмі людини
Інсулін - це дуже малий гормон, що складається з двох ланцюгів амінокислот (А і В ланцюги). Ланцюг А складається з 21 амінокислоти, В ланцюг - 30 амінокислот.
Обидва ланцюги спочатку синтезуються як частина ланцюга 110 АА. Ця довга форма - препроінсулін.
24 амінокислоти цього попередника сигналізують про те, що ендоплазматичний ретикулум приймає його. Ця послідовність сигналів розділяється під час запису.
Решта 86 амінокислот утворюють проінсулін (ланцюги A, B і C). Ланцюги A і B взаємодіють через дисульфідні мости (-S-S-).
Потім С-ланцюг (С-пептид) відокремлюється ферментативно.
С-пептид забезпечує просторово правильне вирівнювання ланцюгів А і В (утворення дисульфідних містків); це єдиний спосіб функціонування інсуліну.
Модифікація попередника білка під час або після трансляції відома як обробка білка.
Як зробити людський інсулін з кишковою паличкою
Крок 1
Модифіковану мРНК проінсуліну виділяють і синтезують за допомогою зворотної транскриптази, утворюючи гібрид РНК-ДНК.
Крок 2
Одноцепочечна ДНК завершується за допомогою ДНК-полімерази. КДНК готова.
крок 3
Стартовий кодон ферментативно приєднується до кДНК інсуліну (А.: TAC для AUG → метіонін, стартовий кодон), а також "липкі кінці" (B.: липкі кінці) додано.
Результат
Готова «пасажирська ДНК», таким чином, складається з «липких кінців», стартового кодону та гена проінсуліну для ланцюгів B, C та A.
Рекомбінувати - включити у вектор
Отримана таким чином чужорідна ДНК тепер включена у вектор pBR322. Вектор містить ген бета-галактозидази та ген стійкості до ампіциліну.
Крок 1
Розрізаючи Eco RI, чужорідна ДНК повинна бути включена в середину гена галактозидази.
Крок 2
Виникають "липкі" кінці, які доповнюють чужорідну ДНК.
крок 3
Взаємодія «липких» кінців вводить чужорідну ДНК у плазміду.
Крок 4
Проміжки закриваються ДНК-лігазами. Рекомбінована плазміда готова.
Значення оперона для експресії генів
Включаючи ген проінсуліну в ген галактозидази, лак-оперон можна використовувати для експресії генів. У той же час білок галактозидази захищає інсуліновий компонент від власних ферментів клітини - протеаз, які в основному негайно розщеплюють менші білки.
Сучасні методи використовують ген триптофан-синтази для поглинання гена проінсуліну, який контролюється ферментною репресією. Оперон тифтафану також містить механізм, який підвищує експресію генів у разі дефіциту триптофану, який може бути технічно добре використаний.
Трансформувати - Виділити - Клонувати
Плазміди вводяться в кишкову паличку шляхом трансформації. Для відбору використовується стійкість до ампіциліну. Рекомбіновані бактерії розмножуються у ферментерах.
З міркувань безпеки ланцюги інсуліну A і B експресувались окремо у двох різних штамах E. coli протягом більш тривалого періоду часу, щоб виключити можливість бактерії синтезувати людський інсулін. Бактерії, обладнані таким чином, спричинять цукровий шок, якщо потраплять у наш кишечник.
Експрес - Змінити
Експресія гена приводиться в рух шляхом додавання лактози. Експресується ген бета-галактозидази з вбудованим геном інсуліну. Створюється злитий білок галактозидази та проінсуліну.
Генний продукт виділяють із живильного середовища центрифугуванням. За допомогою броміду ціаногену частина бета-галактозидази відокремлюється від проинсулина шляхом руйнування вбудованої в неї амінокислоти метіоніну.
Проінсулін модифікується до інсуліну за допомогою ферменту трипсину. Оскільки бактерії не мають необхідного ферменту, його слід додати після очищення.
Виробництво інтерферону бактеріями
Важливість експресії людських генів у клітинах-хазяїнах (бактерії, дріжджі) також ясно з наступного прикладу інтерферону. Як активний інгредієнт для лікування раку або розсіяного склерозу, він був доступний лише кільком людям, перш ніж його виготовляли з генетично модифікованими бактеріями. До цього часу інтерферон отримували з клітин крові. На 400 мг інтерферону потрібно було 50000 літрів крові. Сьогодні його можна виробляти в будь-якій кількості з використанням рекомбінованих клітин кишкової палички.