Застосування маркерів мікрочастинок для вивчення фізіології травлення брахіона
Застосування маркерів мікрочастинок для дослідження фізіології травлення Brachionus plicatilis (Rotatoria) ІНВАГУЛЬНА ДИСЕРТАЦІЯ для здобуття докторського ступеня факультету математики та природничих наук Університету Кельна, представленого Ніколь Анітою Ліндеманн з Дуйсбурзького Кельна 2001
Доповідач: проф. В. Клейнов Проф. Д-р М. Дамбач проф. Д-р Х. Арндт День усного іспиту: 11 травня 2001 р
Зміст 3.2.4 Вплив факторів середовища на проходження їжі 96 3.2.4.1 Мікроскопічне дослідження значення рН у шлунку та кишечнику B. plicatilis 96 3.2.4.2 Вплив значення рН у середовищі 102 3.2.4.3 Порівняння швидкості поглинання та фільтрації у буферизовані середовища 105 3.2.5 Дослідження процесів всмоктування в травному тракті B. plicatilis 116 3.2.5.1 Всмоктування гемоглобіну 116 3.2.5.2 Безпосереднє виявлення всмоктування білків 121 3.3 Підсумкові зауваження та загальна дискусія 125 4. Резюме 130 5. Бібліографія 132 Подяки Пояснення резюме
Анотація Вміст шлунково-кишкового тракту B. plicatilis можна швидко і легко обміняти, ввівши в середовище частинки нового типу. Дріжджові клітини використовувались для заміщення еритроцитів у шлунково-кишковому тракті та вивчення здатності коловерток контролювати потрапляння частинок поживних речовин. Застосування дріжджових клітин, забарвлених бромотимоловим синім, дозволяє визначити різницю у значеннях рН шлунку та кишечника. Крім того, в експериментах з годуванням ці клітини корисні для вивчення відмінностей у секреції іонів H + кишечником у культуральному середовищі різної молярності. Нарешті, абсорбційні процеси можна було продемонструвати, замінивши мічені флуоресценцією примари еритроцитів на немічені примари та виявивши тривалу залишкову флуоресценцію в клітинах шлунку. 2
Матеріал та методи 2. Матеріал та методи 2.1 Часто використовувані скорочення DTT FITC HEPES LSM MES RSA SDS TRA Tris rpm 1,4-Dithio-DL-Threit (ol) Флуоресцеїн Ізотіоціанат N-2-Гідроксиетилпіразин-N -2-етансульфонова кислота Лазерне сканування -Мікроскоп N-морфолін етансульфонова кислота бичачий сироватковий альбумін додецилсульфат натрію триетаноламін гідрохлорид трис (гідроксиметил) амінометан обороти в хвилину 5
Матеріал та методи 2.2 Виробник хімічних речовин, речовина Ступінь чистоти Appli Chem (Дармштадт) Альбумін із бичачої сироватки Цитрат (моногідрат лимонної кислоти) с. a. DTT MES буфер якості гідроксиду натрію р. a. Соляна кислота с. a. TRA с. a. Boehringer (Mannheim) Tris кристалічний Merck (Дармштадт) бромотимол синій бромофенол синій розчин глутаральдегіду 25% хлорид калію с. a. Калій гідрофосфат с. a. Калій гідроксид чистий сульфат магнію 7-гідрат с. a. Карбонат натрію с. a. Натрію хлорид p. a. Натрію дигідрофосфат 1 гідрат р. a. Гідрокарбонат натрію с. a. динатрію гідрофосфату динатрію дигідрат р. a. Суміш морської солі натрію дітіоніт Sera (Heinsberg) 6
Матеріал та методи Виробник, речовина Рівень чистоти Серва (Гейдельберг) Хлорамфенікол Гепарин SDS Сахароза (сахароза) дослідницький клас Кристалічний Sigma (Мюнхен) FITC HEPES Літиказа (від Arthrobacter luteus) Мертіолат (Timerosal) Riedel-de-Haën (Гановер) Амоній гідрогенвуглеводень Хімічні речовини, що не внесені до списку, надходять (у якості па) в Merck, Дармштадт Якщо не вказано інше, використовувані розчини змішували з Aqua bidest. за розкладом. 7-й
Матеріал та методи 2.3 Спеціальні матеріали БРЕНД (Wertheim/Main) Гепаринізовані мікрогематокритні капіляри (довжина: 75 ± 1,00 мм; внутрішній діаметр: 1,15 ± 0,05 мм; зовнішній діаметр: 1,55 ± 0,05 мм), Камера для підрахунку, Нойбауер (глибина камери: 0,1 мм; лічильна мережа: 9 великих квадратів, кожен 1 мм 2) BRAUN (Melsungen) стерильні кров'яні ланцети, Solofix CORNING COSTAR GmbH (Боденхайм) Поліефірна мембрана Tanswell-Clear (діаметр 24 мм, розмір пор 0,4 мкм) PLANO (Wetzlar) Prep-Eze: кошик (тип A) з діаметром очей 75 мкм RAL (Karlsruhe) діалізна трубка з целюлози, Spectra/Por Membrane 3, MWCO: 3500 семінарів фільтрувального апарату Зоологічного інституту (Кельнський університет) (Lindemann & Kleinow, 2000), див. Малюнок 1, що складається з поліетиленової труби із щільно герметичним штампом та двох закритих виходів. Марку покривають марлею Polymon (PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Zurich, розмір вічка 16 мкм). Невеликий апарат для фільтрування, виготовлений із скляного шприца FORTUNA OPTIMA об’ємом 5 мл (Walter Graf and Co. GmbH & Co., Wertheim) із марлевим покриттям (Polymon Gaze PES 16/5, Schweizer Seidengazefabrik AG Zurich, розмір вічка 16 мкм) ПЕ марка; Відвід шприца можна закрити шланговим віджимачем. 8-й
Матеріал та методи 10 см B A C Рис. 1: Фільтруючий пристрій для концентрування коловерток або для видалення дрібних частинок (еритроцитів, клітин водоростей або дріжджів) із середовища, що містить коловороту. Щільно закрита марка, покрита марлею Polymon (розмір вічка 16 мкм) B злив для промивного середовища C злив для концентрованих коловерток без частинок 9
Матеріал та методи 2.4 Методи мікроскопічного спостереження 2.4.1 Світловий мікроскоп Були використані: а) Мікроскоп, що пропускає Ларбулюкс К (Лейц, Вецлар, збільшення між 40 і 1000). б) Мікроскоп заднім ходом Віловерта (Вілл, Вецлар, збільшення між 40 і 320). 2.4.2 Флуоресцентний мікроскоп Флуоресцентні дослідження проводили на флуоресцентному мікроскопі Ортоплана (Leitz, Wetzlar, magnifications 63-400) з фільтром збудження L2 450-490 (сплітер 510, блокуючий фільтр 525/20). Тварин спостерігали на предметних стеклах мікроскопа під захисними окулярами. 2.4.3 Зображення мікроскопа Зображення світлового мікроскопа були зроблені за допомогою рефлекторної камери Minolta X-300 із кріпленням для лінз Leitz Periplan (GF 12,5; TL 160 мм 10). Були використані наступні плівки: Ilford PAN F Plus 50 ASA (чорно-біла негативна плівка), Kodak EKTAR 100 ISO 100/21 (кольорова негативна плівка), Kodak EKTAR 1000-2 (кольорова негативна плівка), Kodak Royal Gold 100 ISO 100/21 (кольорова негативна плівка ), Scotch CHROME 640-T ISO 640/29, 3200 k (кольорова слайд-плівка для світла лампи розжарювання). Синій фільтр був використаний для компенсації легкого жовтого відтінку, спричиненого штучним світлом. 10
Матеріал та методи 1 2 Рис. 2: Спосіб спостереження за окремими тваринами протягом більш тривалого періоду часу. Тварин, утримуваних на місці за допомогою скляного капіляра Pyrex (), спостерігають у живильному середовищі через перевернутий мікроскоп. Скляний капіляр утримується і направляється мікроманіпулятором. Від'ємний тиск у капілярі, що тримається, перевіряється за допомогою шприца об'ємом 2 мл (). 1 = мікроманіпулятор, 2 = предметне скло з насадкою на 1 мл. 16
Матеріали та методи 2.5.4 Іммобілізація коловерток дітіонітом натрію Для того, щоб мікроскопічно дослідити велику кількість коловерток, тварин іммобілізували дітіонітом натрію. 500 мкл середовища, що містить ротори, вводили в реакційний посудину Еппендорфа з 500 мкл дітіоніту натрію (40 мг/мл). Після обробки коловертки опускаються на дно посудини в повністю витягнутому стані. Для визначення загальної кількості тварин та кількості тварин із заповненим (червоним кольором) травним трактом, залежно від концентрації коловерток, з посудини на порожнисте мелене предметне скло піпетували 20-100 мкл. 2.5.5 Виробництво буфера розчинення Виробництво фон Kleinow et al. (1991) розроблений буфер розчинення стався наступним чином: У 2 мл вод. 0,18 M SDS та 0,03 M гідрокарбонат амонію розчиняли (pH 8). Перед початком експерименту до розчину додавали 0,04 г DTT. 17-й
Матеріал та методи 2.6.4 Привиди еритроцитів 2.6.4.1 Приготування альбуміну FITC (Wißling, 1988 та Johnson & Halborow, 1986) З метою запобігання дифузії флуоресцентного барвника з привидів, він зв’язувався з білками: на 0,5 М більше лужного Буфер (рН 9,5) забезпечували додаванням 5,8 мл 5,3 відсотка розчину Na 2 CO 3 до 10 мл 4,2 відсотка розчину NaHCO 3. 50 мг альбуміну забирали у 4,5 мл 0,9% розчину NaCl і додавали 0,5 мл лужного буфера; після ретельного перемішування додавали 1,5 мг FITC і розчин перемішували при 22-25 ° C протягом 2 годин. Цю суміш діалізували протягом ночі проти 4 л фізіологічного сольового розчину в діалізній коромислі. Готовий флуоресцентно-білковий комплекс зберігали в прохолодному та темному місці. 2.6.4.2 Розчини Промивний розчин: гіпосмотичний буфер: Промивний буфер: 0,9% розчин NaCl 5 мм розчин MgSO 4, 160 мм KCl/5 мм розчин HEPES, рН 7,4 Всі розчини використовували для приготування привидів до приблизно C охолоджений. 2.6.4.3 Виробництво ненавантажених і завантажених привидів Свіжу гепаринізовану кров ссавців (овець або великої рогатої худоби) центрифугували при 5000 об/хв при 4 ° С протягом 10 хв. Після декантації супернатанту плазми та верхнього лейкоцитарного шару клітинного стовпа седі-20
Матеріал та методи 2.6.4.4 Привиди, закріплені глутаровим альдегідом Навантажені примари готували та фіксували, як описано в розділах 2.6.3 та 2.6.4, розчин глутаральдегіду додавали до підготовлених та охолоджених привидів без попереднього промивання . 22-го
Матеріал та методи Відбір зразків кошика для ефіру Ротифери Рис. 3: Схематичне зображення проби: Для фотометричних вимірювань зразок піпетується з кошика з фільтром, який доступний для еритроцитів, але не для ротиферів. Це було досягнуто склеюванням 2-3 тканинних кошиків (розмір вічка 75 мкм, Plano GmbH Wetzlar). У першу годину пробу відбирали кожні 5-10 хв, у подальшому ході тесту лише кожні 20-30 хв. Коли відбирали зразки, з кошика фільтра у кювету піпетували 2 мл. Для того, щоб забезпечити, щоб суспензія у вставці фільтра приблизно відповідала концентрації еритроцитів або виділеного гемоглобіну в навколишньому середовищі, вміст фільтруючого кошика кілька разів переносили за допомогою піпетки у зовнішнє середовище перед кожним забором. 24
Матеріал та методи 2.7 Приготування дріжджових клітин 2.7.1 Одержання дріжджової суспензії 0,5 г хлібопекарських дріжджів (Saccharomyces cerevisiae) перемішували в 100 мл морської води, поки дріжджі не розподілялись рівномірно. 2.7.2 Приготування фосфатного буфера за Соренсеном 0,2 М фосфатного буфера рН 7,0 готували шляхом об'єднання 30,5 мл 0,2 М розчину Na 2 HPO 4 і 19,5 мл 0,2 М NaH 2 PO 4 - Рішення зроблено. Ми отримали 0,067 М буфер Серенсена, розбавивши 6,7 частин буфера 13 частинами дистильованої води. (Dawson et al., 1969). 2.7.3 Приготування фосфатного калію буфера KH 2 PO 4 (0,05 М) розчиняли в дистильованій воді. готують і доводять до рН 7 за допомогою КОН. 2.7.4 Фарбування дріжджових клітин індикаторним барвником Замість дріжджових клітин "Preis Microplan", що використовував Клаус Кюле (1983), використовували свіжі хлібопекарські дріжджі, щоб перший етап центрифугування можна було пропустити. Для фарбування дріжджових клітин індикаторним барвником проводили наступні дії: Суспендування 250 мг свіжих хлібопекарських дріжджів у пробірці в 5,0 мл 1/15 М фосфатного буфера (Sørensen) pH 7,0. - Додавання 25 мг бромотимолового синього (діапазон показників рН 6,0-7,8; зміна кольору з жовтого (кислого) на синій (основний)) або брому - 26
a b c d Рис. 4a-d: Поглинання та передача еритроцитів у травному тракті B. plicatilis. Типова послідовність після додавання еритроцитів в момент часу 0, спостерігається на коловороті, яка утримувалася при відкритті скляного капіляра Pyrex відсмоктуванням. При такому збільшенні було неможливо сфотографувати всю тварину у фокусі. Через рух тварин у середовищі довелося вибирати короткий час експозиції з великою апертурою. Калібрувальний бар = 100 мкм. а) Через 10-20 секунд шлунок стає злегка червоним. б) Через 180 секунд шлунок явно наповнений, і видно перший колір кишечника. в) Через 15 хвилин шлунок і кишечник пофарбовані в інтенсивний червоний колір. г) Через 17 хвилин вміст кишечника викидається через задній прохід. Процеси проходження після першого процесу, як правило, прискорювались, так що наступна евакуація кишечника відбувалась лише через 10 хвилин. У всіх використовуваних еритроцитах ссавців (люди, велика рогата худоба та вівці) у фекаліях видно лише фрагменти мембрани та червону кольорову хмару, що складається з виділеного гемоглобіну, який швидко поширюється в середовищі. В окремих випадках, які все ще помітні під час першого спорожнення кишечника, 30
Якби такі проблеми можна було вирішити, використання привидів, наповнених фторогенними ферментними субстратами, було б можливим для подальших досліджень. Цей метод можна використовувати, наприклад Локалізуйте ферменти в травному тракті. a b Рис. 5a-b: Яскраве поле та флуоресцентна фотозйомка гриби через 5 хв після годування примарами, наповненими міченим FITC альбуміном (калібрувальний бар = 50 мкм). 50 мкл суспензії з примарами альбуміну FITC додавали до 500 мкл середовища, що містить коловертки. Забираючи частинки протягом п’яти хвилин, коловертки звільнялися від вільних флюоресцентних привидів, кілька разів промиваючи їх нейлоновим фільтром 16 мкм, а зразок тварини переносили на предметне скло з покривним склом. а) Флуоресцентне зображення, б) для локалізації флуоресценції в шлунково-кишковому тракті, зображення А було перевернуто і розміщено над яскравим польовим зображенням тієї самої тварини. 33