3D гідрогелеві риштування для суглобової культури хондроцитів та протоколу генерації хряща

Протокол

Усі експерименти виконувались відповідно до Керівних принципів Стенфордського університету щодо людини та затвердженого протоколу Ради з оцінки інституцій.

1. Виділення суглобових хондроцитів

2. Виробництво біоміметичного гідрогелю

Примітка: Цей метод дозволяє біоміметично синтезувати гідрогель, що містить полі (етиленгліколь діакрилат) (PEGDA, МВ 5000 г/моль), хондроїтинсульфатметакрилат (CS-MA) у DPBS. Додавання фотоініціатора дозволяє фотоактивоване зшивання. Кінцева композиція гідрогелю містить 7% мас./Об. (PEGDA), 3% мас./Об. CS-MA та 0,05% мас./Об. Фотоініціатора.

  1. Синтезуйте CS-MA шляхом функціоналізації полімеру CS з метакрилатними групами.
    1. Приготуйте забуференний розчин 50 мМ 2-морфоліноетансульфонової кислоти (MES) та 0,5 M хлориду натрію (NaCl), розчиняючи 1,952 г MES та 5,84 г NaCl у 200 мл деіонізованої води (DIH) 2 O). Розчиніть у буферному розчині 5 г натрієвої солі хондроїтинсульфату.
    2. Додайте 0,532 г (4,62 ммоль) N-гідроксисукцініміду (NHS) та 1,777 г (9,24 ммоль) (3-диметиламінопропіл) карбодіїміду гідрохлориду (EDC) 1-етил-3- (NHS: EDC молярне співвідношення = 1: 2) розчину і перемішують протягом 5 хв.
    3. Додайте до розчину 0,765 г (4,62 ммоль) 2-аміноетилметакрилату (AEMA) (молярне співвідношення NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) і витримуйте реакцію при кімнатній температурі протягом 24 годин.
    4. Очищають суміш діалізом проти деіонізованої води (diH 2 O) протягом 4 днів за допомогою діалізної трубки (12-14 кДа MWCO).
    5. Відфільтруйте очищений розчин через фільтр 0,22 мкм і помістіть відкриті пробірки, що містять розчин, в ексикаторі та вакуумі O/N. Переконайтесь, що всі пробірки захищені від світла. Зберігайте розчинений полімер при -20 ° C, захищений від світла та вологи.

3. Клітинна інкапсуляція

4. Екстракція РНК та аналіз експресії генів

  1. Акуратно аспіруйте середовище та покладіть стерильний 1X PBS на завантажену камеру разом із порожніми контрольними гідрогелями.
  2. За допомогою стерильного шпателя перенесіть кожен гідрогель у чисту пробірку Еппендорфа об’ємом 1,5 мл і додайте до кожної пробірки 250 мкл триреагенту. Дотримуйтесь інструкцій виробника для виділення РНК.
  3. Після виділення РНК та кількісного визначення використовуйте по 1 мкг кожного зразка та виконайте зворотну транскрипцію в кДНК за допомогою набору зворотної транскрипції кДНК високої ємності.
  4. Використовувати кількісну ПЛР TaqMan Arrays Gene Expression для вивчення експресії ваших генів, що цікавлять. Нормалізувати рівні експресії генів усередині GAPDH.
  5. Для умов ПЛР передбачають інкубацію 2 хвилини при 50 ° C для інактивації попередніх ампліконів урациловою ДНК-глікозилазою, а потім 1060; мінімальна інкубація при 95 ° C для активації Taq-полімерази. Потім виконують сорок циклів ПЛР, що складаються з 15 секунд при 95 ° С і 1 хв при 60 ° С.

5. Біохімічні аналізи

6. Механічні випробування

  1. Виконайте тести на стиснення без обмежень, використовуючи тест-систему Instron 5944, оснащену тензодатчиком 10 Н.
    1. Після бажаних днів культури in vitro проведіть тест на компресію на клітинно-гідрогелевій лісі та безклітинних контрольних гідрогелях.
    2. Занурюють зразки у ванну з PBS при кімнатній температурі та стискають зі швидкістю деформації 1%/сек до деформації до 15% від фізіологічного штаму 11.12, відомого хрящовій тканині в умовах навантаження, як повідомляється, при 10-20% 13.14.
  2. Створіть напругу на основі кривих напружень і підлаштуйте криву, використовуючи поліноміальне рівняння третього порядку. Визначте модуль дотичної стиснення рівняння підгонки кривої для значень напружень 15%.

Репрезентативні результати

Біоактивні гідрогелі, що містять групи ПЕГ та КС (Малюнок 1) представляють ідеальну платформу для культури і дозрівання суглобових хондроцитів людини 2,3,5,7. Хондроцити різного віку та станів хвороби можна культивувати за допомогою описаного та проаналізованого методу для визначення їх фенотипу, експресії генів та біохімічних та механічних властивостей утвореної хрящової тканини. Три зразки хондроцитів, ювенільні - 6 місяців, 34 роки та дорослі - остеоартритичні - 74 роки, були зібрані після 3 тижнів посіву у 3D-біоміметичних гідрогелях. Аналіз експресії генів нормальних хондроцитів, як неповнолітніх, так і дорослих, показав збільшення експресії генів хондроцитів COL2A1 та COL6A1. Навпаки, хворі хондроцити демонстрували різке зниження Col2a1, зберігаючи експресію COL6A1. (рисунок 2) демонструє втрату хондрогенного фенотипу, незважаючи на вирощування у сприятливому біоміметичному середовищі.

Наявність фізичних риштувань дозволяє оцінити біомеханічні властивості зразків за допомогою випробувань на необмежене стиснення 2,3. У той час як безклітинні гідрогелі зазнають зниженого модуля компресії, клітинні конструкції, відповідальні за підтримку модулів у компресії, через 3 тижні в культурі (рисунок 4). Описані тут фенотипові, біохімічні та біомеханічні аналізи корисні для оцінки та розуміння потенціалу різних популяцій хондроцитів для інженерного хряща.

риштування
Рисунок 1. Біоміметичні гідрогелі PEG-CS для хондроцитів 3D-осатюра. Хондроцити ресуспендують у суміші, що містить полі (етиленгліколь діакрилат) (PEGDA) та хондроїтинсульфатметакрилат (CS-MA), і заливають у циліндричну гелеутворювальну форму. Після впливу ультрафіолетових променів затверділі гелі збирають із форм і оцінюють життєздатність клітин шляхом фарбування живих мертвих через 24 години після інкапсуляції. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 2. Експресія хондрогенних генів у хондроцитах людини, культивованих у 3D біоміметичних гідрогелях. Кількісна експресія генів хрящових маркерів Col2a1 та COL6A1 юнацькими, дорослими та OA-хондроцитами після 3 тижнів культивування у 3D-біоміметичних гідрогелях. Значення нормуються до рівня експресії гена на 1-й день. Смужки помилок представляють середнє значення ± SD. p * 2 Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 3. Вміст ДНК в хондроцитах людини, культивованих у 3D біоміметичних гідрогелях. Кількісна оцінка ДНК за допомогою аналізу Пікогрін у неповнолітніх, дорослих та хондроцитів ОА після 3-тижневого посіву в 3D-біоміметичних гідрогелях. Значення нормалізуються до рівня ДНК на перший день. Клацніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Рисунок 4. Вимірювання вмісту GAG та аналіз не обмеженого стиснення хондроцитів людини на 1 день та після 3 тижнів посіву у 3D біоміметичних гідрогелях. (AT) Кількісне визначення GAG методом аналізу DMMB у хондроцитах на 1 день та після 3 тижнів культури, 3D біоміметичні гідрогелі. Значення нормуються до вологої ваги (ww) і виражаються в пг/г. (B) Модуль стиснення (кПа) безклітинних та клітинно заряджених гідрогелів на 1 день та після 3 тижнів культивування у 3D біоміметичних гідрогелях. Натисніть тут, щоб переглянути збільшену версію цього малюнка.

Обговорення

Як зазначено в цьому протоколі, 3D-гідрогелі здатні підтримувати фенотип хондроцитів у культурі, уникаючи процесу дедіференціації клітин у фіброзно-хрящових клітинах, які зазвичай зустрічаються з 15 одношаровими культурами. який підтримує внутрішні клітинні характеристики, пов’язані з віком та захворюваннями.

Використання 3D-біоміметичного гідрогелю має ряд переваг. По-перше, включення хондроїтину сульфату (CS), головного компонента, що знаходиться в суглобовому хрящі, дозволяє клітинам деградувати матрикс гідрогелю, секретуючи хондроїтиназу та приєднуючи новосинтезований позаклітинний матрикс хряща 5, 16 Крім того, було показано, що CS має анти- запальні властивості артритного суглоба. Біоміметичний гідрогель також може бути використаний як матеріал підмостки для розподілу клітин при відновленні хряща і може бути хімічно модифікований для полегшення кращої інтеграції тканинного біоматеріалу 17,18.

Застосування гідрогелів PEG-CS дозволяє тривалий час проводити посіви хондроцитів та оцінювати біохімічні та механічні властивості. Тут ми показуємо, як ця платформа може бути корисною для порівняльного аналізу різних джерел диференційованих хондроцитів з метою визначення оптимального типу клітин для інженерії хряща. Цікаво, що хондроцити, інкапсульовані у гідрогелях, залишаються життєздатними та розмножуються відповідно до своїх власних здібностей. Склад гідрогелю фактично підтримує ріст здорових молодих і дорослих хондроцитів, як показано в Малюнок 2. Склад і структура описаних гідрогелів також сприяє утворенню хрящової тканини, на що вказує відкладення функціонального позаклітинного матриксу, оціненого кількісною оцінкою глікозаміногліканів (GAG).

Додатковою перевагою є те, що гідрогелеві хондроцитарні конструкції можна оцінити на предмет механічних властивостей новоутвореної хрящової тканини. Зверніть увагу, що для порівняння слід проводити простий тест на стиск на безклітинному гідрогелі. Насправді гідрогелям властива жорсткість завдяки жорсткості груп CS. Простий компресійний штам 5-20% (зі швидкістю деформації 1%/с) може застосовуватися для механічного контролю хрящової тканини 11,12, оскільки, як повідомляється, фізіологічний штам, відомий хрящовою тканиною в умовах навантаження, становить 10- 20 13,14%. Реакцію як заряджених клітин, так і безклітинних гідрогелів на механічно керовані гідрогелі оцінювали в культурі кінцевої точки. У прикладі, описаному вище, ми спостерігали порівнянну жорсткість конструкцій, що містять неповнолітні та дорослі хондроцити, на відміну від нижчої жорсткості конструкцій, що містять хондроцити ОА. Такі механічні властивості гідрогелевої клітинної конструкції дозволяють оцінити функціональні властивості сформованої тканини, даючи глибокий аналіз здатності дозрівання клітин.

На закінчення можна сказати, що використання 3D-біоміметичних гідрогелів для вивчення різного популяційного потенціалу хондроцитів для формування хрящової тканини може бути широко застосовано. На додаток до досліджень in vitro, описаних тут, трансплантація заряджених клітинних конструкцій in vivo може розглядатися для вивчення потенціалу дозрівання та регенерації клітин у фізіологічному контексті. Інші модифікації гідрогелевої платформи з додатковими біоміметичними факторами також можуть бути розглянуті для оптимізації проліферації та дозрівання хондроцитів.