56-та нефректомія в поєднанні з дієтою з високим вмістом солі та інгібуванням синтази оксиду азоту для індукування

Резюме

Описана двоетапна процедура встановлення хронічної ниркової недостатності (ХНН) у щура Льюїса шляхом хірургічного видалення 5/6-ї частини ниркової маси. Поєднання хірургічного втручання, інгібування NOS та дієти з високим вмістом солі призводить до моделі, подібної до ХХН людини, що дозволяє вивчати причинно-наслідкові механізми та розробляти нові терапевтичні втручання.

Анотація

Вступ

Через свій прогресивний характер, подальшу термінальну стадію захворювання нирок та пов’язану із цим серцево-судинну захворюваність та смертність ХХН є зростаючою проблемою громадського здоров’я. Тому уповільнення прогресування ХХН є величезним пріоритетом для здоров'я. Оскільки ХХН характеризується складними порушеннями гомеостазу, для вивчення розвитку та прогресування ХХН необхідні інтегративні моделі тварин. Нирка складається з безлічі різних типів клітин, які взаємодіють між собою. Цю складність не можна імітувати in vitro.

Протокол

Усі експерименти проводяться відповідно до етичних рекомендацій експериментальних тварин на Утрехтському лабораторному комітеті тварин. Протокол ведеться під керівництвом та схваленням авторського Комітету з догляду та використання тварин.

ХХН індукується у самців інбредних щурів Льюїса (річка Чарльз, Сульцфельд, Німеччина) у віці 8 тижнів. Щурів утримують у стандартних умовах у світлі, температурі та вологості.

  1. Стерилізуйте хірургічні інструменти:
    • 1 студент щипцями 1-2 зуби 12 см
    • 1 студент стандартних плоскогубців
    • 2 плоскогубці Semken
    • 1 ножиці Мейо
    • 1 студентка ножиць Ірис
    • 1 Голкотримач Olsen-Hegar з ножицями
    • Ковдра
  2. Перевірити інвентарний список:
    • Операційний стіл з утеплювальною подушкою та лампою
    • O 2, ізофлуран
    • тканина
    • Бритва
    • Ваги
    • Стерильна робоча установка
    • Стерильна марля 5х5 та 10х10
    • 70% алкоголю
    • 0,9% розчин NaCl
    • 1 мл шприц
    • Голки (25G)
    • Гелеві пінопластові прокладки: спонгостан
    • Вікрил 4,0 та 5,0
    • Бупренорфін 0,03 мг/кг (розведений 1:10 у фізіологічному сольовому розчині)
    • Чиста клітка для щурів після операції

2. Унінефректомія правої сторони

3. Лівобічна субтотальна нефректомія

  1. Через сім днів проводять ті самі препарати зліва для правого боку, як описано в 2.1 - 2.5. Перед операцією обчислюється кількість ниркової тканини, яку потрібно видалити, що становить приблизно 2/3 ваги правої нирки. Перед операцією підготуйте невеликі шматочки гелевої піни (Спонгостан, Джонсон та Джонсон, Нью-Джерсі).
  2. Помістіть гострі ножиці навколо верхнього полюса лівої нирки та резекції верхнього полюса одним махом (щодо розташування ножиць див. Малюнок 3). Негайно накрийте шматочком гелевої піни і злегка натискайте стерильною марлею.
  3. Повторіть з нижнім полюсом нирки, як у 3.3.
  4. Підніміть нирку, щоб запобігти згортанню шкіри. Зберігайте легкий тиск на обидві прокладки з гелевої піни стерильною марлею, доки кровотеча не зупиниться. Якщо кровотеча продовжується, додайте ще один поролоновий килимок.
  5. Помістіть залишки нирок клейкими гелевими пінопластовими подушечками в живіт. Закрийте м’язи та шкіру та дотримуйтесь 2.9-2.12.

  1. Фіктивне спостереження пройшло ту саму процедуру, щоб оголити нирки. Замість того, щоб викоренити нирку або перерізати палички через тиждень, обидві нирки декапсулюють з інтервалом в один тиждень, не турбуючи для порушення роботи надниркових залоз. Закриття ран та післяопераційний догляд однакові до 2.11 та 2.12.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Після субтотальної нефректомії залишається приблизно 1: 6 від загальної маси нирок. Малюнок 4 показує вагу видаленої частини правої нирки із середнім та стандартним відхиленням у двох попередніх експериментах. Слід пам’ятати, що на тижні після UNX відбувається гіпертрофія лівої нирки, що вказує на те, що вага, яка повинна бути розрахована на основі ваги правої нирки, завжди призводить до від’їзду менше 5/6. Однак, оскільки під час хірургічного втручання неможливо визначити вагу лівої нирки, це точний спосіб видалення приблизно 5/6-ї вихідної маси нирок.

З часом у щурів із ХХН розвивається гіпертонія, уремія, анемія, протеїнурія та значне зниження ШКФ та ERPF. Через 6 тижнів ХХН встановився, підходящий момент для перевірки рятувальних заходів. З часом спостерігається різке прогресування гіпертонії та протеїнурії, тоді як гематокрит та функція нирок (СКФ та ERPF) демонструють легке погіршення (Малюнок 5). Іншими симптомами, на які ми не зосередилися у своїх експериментах, є порушення в обміні фосфатів кальцію та ліпідів та багато інших. Залежно від стресу на щурах, розвиток ХХН може сильно варіювати в 14, 15, 2. Ми використовували дієту з високим вмістом солі та блокатор NO, щоб викликати високий кров'яний тиск та дисфункцію ендотелію.

Прогресування ниркової недостатності відстежується шляхом збору сечі (використовується для вимірювання кількості білка та креатиніну), крові (сечовини та креатиніну в плазмі крові) та систолічного артеріального тиску. Ми знаємо, що розвиток високого кров'яного тиску можна більш точно відстежувати, використовуючи телеметрію замість плетизмографії хвостової манжети. Кліренс креатиніну можна розрахувати, але він, як правило, недооцінює зниження ШКФ через велику канальцеву секрецію креатиніну у щурів 16, підкреслюючи важливість золотого стандартного методу визначення функції нирок шляхом визначення кліренсу інуліну та ПАУ 17, 18, 19 . Koeners та ін. описав всю процедуру 20. Кліренс інуліну та ПАУ, розрахований на основі їх концентрації у зразку сечі (U), швидкості потоку сечі (V) та їх концентрації у плазмі (P). Раніше ми продемонстрували значне зниження ШКФ та ERPF у цій моделі за допомогою класичної технології кліренсу, хоча це було менш очевидним із-за змін у плазмі креатиніну, плазми сечовини або кліренсу креатиніну 13.

поєднанні
Рисунок 1. Часова лінія L-NNA, дієта з високим вмістом солі, UNX та SNX. Наведені поздовжні вимірювання функції нирок та момент часу припинення для визначення. При більш тривалому спостереженні після потреби SNX, 6% живлення NaCl можна продовжувати з часом.

98fig2.jpg "/>Рисунок 2. Розтин надниркових залоз. Щоб видалити надниркову залозу, не турбуючи її, покладіть щипці в жир між ниркою та наднирковою залозою і рухайтеся від полюса судини до кінчика, як вказуючи через червону лінію. Ілюстрація адаптована до 20-го американського видання "Анатомія жаху людського тіла", 1918 рік.

поєднанні
Малюнок 3. Проміжний підсумок нефректомії. Червоні лінії показують ріжучі кромки. Ілюстрація адаптована до 20-го американського видання "Анатомія жаху людського тіла", 1918 рік.

поєднанні
Малюнок 4. Частина видаленої ниркової тканини після проміжної нефректомії в двох різних експериментах. Досвід 1, n = 16, досвід 2, n = 23.

високим
Малюнок 5. Розвиток ниркової недостатності у щурів із ХХН закінчився через 6 тижнів після SNX (пунктирними лініями n = 5) порівняно зі здоровими контролями (пунктирними лініями n = 5), а у щурів ХХН закінчився 12 тижнів після SNX (£ n = 8) проти здорових контрольних груп (• n = 8 ). Щури з ХХН отримували L-NNA до 4-го тижня та дієту з високим вмістом солі з 1-го тижня до припинення (не показано на графіку). SNX індукує гіпертонію (вимірюється за допомогою плетизмографії вихлопних газів) (A), Уремія (B), анемія (C) і протеїнурія (D) і значне зниження СКФ (E) та ERPF (F) 13. * Зазначена p Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Хірургічне видалення 5/6-ї частини ниркової маси у щура Льюїса в поєднанні з дієтою з високим вмістом солі та тимчасовим пригніченням NOS приводить до моделі ХХН, яка нагадує ХХН людини, і дозволяє дослідити причинно-наслідкові механізми та ефективність терапевтичних втручань у ХХН.

Модель 5/6-ї нефректомії є добре відомою і широко описаною моделлю ХХН. Однак просто видалення 5/6 частини ниркової маси не відразу спричиняє ниркову недостатність у всіх штамів щурів. Ми використовуємо щурів Льюїса для вивчення ефектів клітинної терапії при ХХН, оскільки наявність щурів GFP + Льюїса може відстежувати клітини, що вводяться донорськими клітинами у щурів-реципієнтів (не GFP +). Щур Льюїса відносно стійкий до розвитку ниркової недостатності, а розвиток ХХН повільний у порівнянні з іншими штамами 22, 15. Тому видалення 5/6-ї ниркової маси поєднується з виснаженням NO і дієтою з високим вмістом солі, оскільки це нагадує кілька аспектів ХХН у людини, такі як велике споживання солі та дисфункція ендотелію. Читачі повинні пам’ятати, що потреба у поєднанні 5/6-ї нефректомії з дієтою з високим вмістом солі та/або відсутністю втоми залежить від штаму щурів, що використовуються для експериментів.

Ми провели 5/6-ю нефректомію двохетапною, а не одноетапною процедурою, оскільки це розглядається як менш стресовий стан для тварини, пов’язаний із меншою смертністю, пов’язаною з хірургічним втручанням, і надає перевагу нашому комітету з випробувань тварин. Ми віддали перевагу розрізу флангу, а не лапаратомії, щоб дістати нирки, оскільки лапаротомія пов’язана з більш високим ризиком зараження рани, розпушення швів, грижі підшкірного диска та спайок кишечника порівняно з розрізом флангу. Крім того, якщо експериментальна конструкція передбачає втручання з розрізом живота - як це відбувається в наших експериментальних дослідженнях над введенням клітин кісткового мозку в ниркову артерію залишкової нирки, виконуючі лапаротомії для SNX не є прихильником, оскільки слід уникати повторних лапаротомій.

Кілька критичних проблем можуть виникнути після хірургічного видалення 5/6 частини ниркової маси. Під час UNX можуть виникнути труднощі зі стабілізацією нирок, оскільки навколишній жир легко розпушується. Для оголення нирки можна використовувати два методи. 1) Використовуйте менші щипці, щоб утримати ниркові судини, плавно рухаючись вниз від нижнього полюса нирки до судинної системи і обережно потягуючи, поки ви не зможете стабілізувати нирку. 2) За допомогою тупих щипців обережно видаліть нирку з живота. Коли нирка оголена, марлю можна використовувати для зупинки кровотечі, яка виникає під час цього процесу. Щоб уникнути кровотечі, жир починає тягнути в нижньому полюсі нирки, де жир сильно прикріплений до нирки.

Важливо створити між вузлом навколо судини нирки та ниркою, щоб запобігти кровотечі після видалення нирки, оскільки вузол буде зісковзувати з ниркових судин внаслідок надходить потоку крові, швидко наповнюючи живіт кров’ю. Для видалення крові можна використовувати марлю, а для зупинки кровотечі - тиск. За допомогою щипців захопіть нирку і створіть нову лігатуру. Якщо судин нирок неможливо простежити, утримуйте тиск, доки кровотеча не зупиниться. 1 мл фізіологічного сольового розчину для запобігання зневоднення через кровотечі в черевній порожнині і почекайте близько 5 хв, перш ніж закрити м’язовий і шкірний шар. Додатково ретельно стежте за щурами протягом наступних днів. Якщо пов’язка існує до видалення нирки, але ниркові судини працюють, довгі кінці лігатури можна використовувати для відв’язування судин.

Якщо після розсічення полюса, незважаючи на утримання тиску на піногелевих подушечках, є кровотеча, це, ймовірно, через пошкодження великої ниркової артерії або ниркової миски. Цю кровотечу можна зупинити, поклавши нові гелеві пінопластові прокладки на рану, не заважаючи рухати пінопластову подушечку, піднімаючи залишок, оскільки більші судини знаходяться біля пупка, і чекаючи довший проміжок часу.

Кров у сечі може повернутися до 2 днів після операції. Якщо ниркова миска пошкоджена або спостерігається велика ниркова функціональна кровотеча, залишаться сліди стійкої гематурії. Щурів із стійкою гематурією після операції необхідно евтаназувати, оскільки зупинити кровотечу неможливо. Якщо гематурія спостерігається пізніше після операції, яка може виникнути до 2 тижнів після операції, щура також слід евтаназіювати, оскільки кров згорнулася в нирковій мисці і в кінцевому підсумку закупорює сечоводи та сечовий міхур, що спричиняє закупорку.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.