Біохімія очищення білка
Очищення білка - це процес, який складається з декількох етапів: початкова екстракція, диференціальне осадження, діаліз, хроматографії різних типів тощо.
ТЕОРЕТИЧНІ ПРИНЦИПИ
Основні етапи очищення
Як правило, спочатку ми подрібнюємо матеріал, з якого хочемо витягти білок (тваринна тканина, частина рослин, бактерії тощо). Для цього можуть бути використані різні пристрої ("Waring Blender", прилад Поттера-Евельхема, "Polytron" тощо). Ця гомогенізація відбувається в буфері відповідного складу. Цей крок, очевидно, перший.
Потім використовуються різні методи, щоб відокремити бажаний білок від усіх інших присутніх. Зазвичай перші кроки - це не дуже специфічні методи, але вони добре підходять для обробки великих обсягів. Потім, по мірі того, як кроки йдуть далі, використовуються дедалі більш специфічні методики, які часто застосовуються до препаратів зменшеного об’єму.
Одним із методів, який найкраще підходить для великих обсягів, є диференціальне осадження сульфату амонію. Ось чому його дуже часто використовують відразу після гомогенізації для позбавлення від основної маси забруднень.
Іонообмінна хроматографія або афінна хроматографія, що застосовуються до великих обсягів зразків, але мають досить хорошу розділяючу здатність, є хорошими проміжними методами.
Врешті-решт, часто використовується молекулярне просіювання або ізофокусування, що дозволяє уточнити чистоту, але вимагає дуже малих обсягів концентрованого білка.
Часто між цими етапами необхідно видаляти солі або продукти, що використовуються в цих хроматографіях. Потім застосовується діаліз або ультрафільтрація. Якщо нам потрібно сконцентрувати препарат, його заморожують. Якщо хтось хоче уникнути цих процедур, він повинен вибрати методи, на які ці продукти не впливають негативно.
Білковий аналіз та аналіз білкової активності
Усі ці кроки слід ретельно дотримуватися, щоб перевірити, чи працюють методи добре. Для цього дуже часто вимірюють білок, що підлягає очищенню, після кожного етапу. Тому необхідно мати метод аналізу (ферментативний, імунологічний, біологічний тощо), щоб прослідкувати процес. Ми також вимірюємо загальну кількість білка. Це останнє значення буде використано для розрахунку питомої активності (див. Таблицю очищення)
У випадку, коли білок виділяється вперше, потрібно буде розробити метод аналізу ще до того, як розробити метод очищення.
Таблиця очищення та критерії чистоти
На всіх цих етапах важливо оцінити два ключові фактори - чистоту та врожайність. Вихід (кількість отриманого білка) легко виміряти за допомогою ферментного аналізу, RIA тощо. Таблиця очищення (див. Розділ "розрахунки") також є дуже корисним інструментом для цієї мети. Якщо буде виявлено, що один із етапів очищення спричиняє значну втрату активності або кількості білка, необхідно поставити під сумнів його корисність або якість його дії. Специфічна активність є кількісним показником чистоти препарату. Тут ще раз, якщо ми помічаємо, що крок не дозволяє збільшити чистоту, ми тоді повинні поставити під сумнів його актуальність. Щоб мати можливість розрахувати вихід і очищення, не забудьте виміряти загальний об'єм фракції, отриманої після кожного етапу, і взяти з неї проби, які дозволять визначити загальний білок і кількість білка qu 'we спробувати ізолювати.
Чистоту білкового препарату також можна оцінити за якісними критеріями. Таким чином, його можна легко якісно візуалізувати за допомогою електрофорезу з високою роздільною здатністю або ізоелектричного фокусування. Якщо видно лише одну білкову смужку, можна зробити висновок, що препарат містить лише один білок. Однак ця якісна оцінка може бути спотворена, якщо білок забруднений однією або кількома іншими однаковою рухливістю в умовах електрофорезу або фокусування. Ці методи також дозволяють стежити за очищенням і перевіряти, чи зменшується кількість забруднюючих білків у міру того, як процес завершується, в ідеалі, одним видом білка.
МЕТОДИКА І АПАРАТ
На всіх цих етапах очевидно необхідно уникати денатурації білка, який ви хочете виділити. Тому необхідно використовувати середовища, характеристики яких сумісні зі стабільністю білків (рН, іонна сила, осмолярність, солі, антиоксиданти тощо). Для цього виробляються певні більш-менш «фізіологічні» середовища, такі як PBS або фізіологічний розчин, які мають деякі з цих властивостей. Таким чином, сольовий розчин (150 мМ NaCl або 0,85%) має майже фізіологічну осмолярність 300 мОс. Часто для підтримання рН використовується буфер (зазвичай близько 7,4). PBS ("сольовий розчин, забуференний фосфатом") містить фосфатний буфер, рН 7,4, а осмолярність суми всіх його компонентів становить 315 мОс. Фізіологічні середовища обговорюються в розділі "Фізіологічні розчини" SIITUB.
Для підтримання рН на адекватному рівні в розчини зазвичай включають буферний продукт. Фосфат (як одно- і двоосновна суміш) використовується в PBS. Тріс (тришідрокси-метил-амінометан) дуже часто використовують через його низьку вартість, навіть якщо він не дуже ефективний при рН 7,4 і пригнічує певні фізіологічні реакції. Також часто використовується гепес (гідроксиетил-піперазин-етан-сульфат). Якості та дефекти основних продуктів, що використовуються для буферування pH у фізіологічних розчинах, обговорюються в розділі "pHmetry" SIITUB.
Важливо також уникати денатурації білків, виставляючи їх на повітря або пінячи, що спричиняє денатурацію та сприяє окисленню. Це особливо стосується окислення тіолової функції цистеїнів до цистинів, тобто утворення дисульфідного зв’язку. Цитоплазматичні білки особливо чутливі, оскільки їх природне середовище, цитозоль, дещо відновлюється. Тому вони не витримують їх солюбілізації в навколишньому середовищі, яке окислюється. Для захисту цих білків часто рекомендується використання антиоксидантів, таких як β -меркапто-етанол або один із реагентів Кліленда, дитиотреитол або дитиотретреол. Білки позаклітинних компартментів (крові, ліквору та ін.) Набагато менш сприйнятливі до цієї проблеми, оскільки вони є слабоокислювальними середовищами. Білки цих компартментів не містять або мають дуже мало вільних тіолів, а навпаки, дисульфідні зв’язки.
Працюючи з білками в дуже малих кількостях, важливо уникати забруднення препарату протеазами. Джерела протеаз можуть бути ендогенними, присутні в самому препараті, наприклад, у лізосомах, які руйнуються під час подрібнення клітин або в присутності миючих засобів. Є також екзогенні джерела, що надходять ззовні, такі як руки, слина тощо.
Збереження та зберігання білків
Наявність ЕДТА для хелатування іонів металів може бути корисною, оскільки останні прискорюють реакції окислення білків. Робота при низькій температурі, «на льоду», також уповільнює процес денатурації. Особливо слід контролювати операції механічної гомогенізації та центрифугування, оскільки вони часто спричиняють перегрів екстракту.
Виділяючи або працюючи з невеликою кількістю білка, важливо уникати забруднення препарату протеазами. Джерела протеаз можуть бути ендогенними, присутні в самому препараті, наприклад, у лізосомах, які розпадаються під час дроблення клітин. Деякі тканини, такі як підшлункова залоза, містять її велику кількість. Вони також можуть бути екзогенними, надходити ззовні, як руки, слина тощо. Існує безліч комерційних препаратів інгібіторів, що мають різні особливості щодо типу протеази. Ці інгібітори можуть бути простими хімічними речовинами, такими як ЕДТА, який блокує металопротеази. Існують також спеціалізовані хімічні речовини, такі як фенілметилсульфонілфторид (PMSF), який інгібує серинові протеази. Також використовуються біологічні інгібітори, такі як пепстатин, α2-макроглобулін та ін. Можна навіть отримати суміші, що містять "коктейль" з різних інгібіторів.
РОЗРАХУНКИ
Очисний стіл
Чистота білкового препарату виражається розмовою про його специфічну активність. Активність - це кількість білка, виражена не у вазі, а в каталітичній чи біологічній здатності. Специфічна активність - це активність щодо загальної кількості всіх білків у препараті. Як правило, це виражається в одиницях (ферментативних або інших) на масу загального білка (наприклад, 12,34 Од/мг білка). Чим вища питома активність, тим чистіший білок. Загальноприйнятим є отримання коефіцієнтів очищення порядку 5000 разів і виходу порядку 5%.
Концентрацію загальних білків зазвичай отримують шляхом аналізу загальної кількості білків у зразках, зібраних під час різних фракцій, отриманих під час очищення. Ми робимо те ж саме для білка, який виділено спеціально: ми вимірюємо кількість цього білка, а не ферментативний аналіз, якщо він є ферментом. Якщо білок не має ферментативної активності, можуть бути використані біопроби, еліза, RIA тощо. Щоб знати загальну кількість прореїнів (загальну кількість або цікавить), також необхідно знати об’єм даної фракції: [білки у фракції] * об’єм фракції (наприклад, мг/мл * мл).
Загальноприйнято узагальнювати етапи очищення білка за таблицею очищення. Таблиця очищення виглядає так:
Іонообмінна хроматографія
Ця таблиця служить, щоб показати роль та ефективність кожного етапу в процесі очищення. Тут використовуються точні поняття та терміни. Коефіцієнт очищення - це кількість разів, коли певна активність може бути сконцентрована (щодо першого етапу) під час кожного з інших етапів процедури. Зазвичай це значення все вище і вище по мірі прогресування стадій. Насправді метою очищення є саме отримання все більш чистого білка, тому має препарат, питома активність якого стає все більш високою. Вихід очищення - це частка, у%, кількості очищеного білка, яка залишається порівняно з початковою кількістю. Урожайність зменшується на кожному етапі, оскільки неминуче виникатимуть матеріальні втрати на кожному етапі. Отже, очищення є "компромісом" між прагненням отримати максимально чистий білок (високий коефіцієнт очищення) в максимальній кількості (високий вихід). Насправді кожен додатковий етап, який дає змогу підвищити чистоту, спричинює втрати матеріалу, а отже, зменшує вихід. Під час типового очищення коефіцієнт очищення збільшується з кроками, тоді як одночасно вихід зменшується.
Для побудови такої таблиці кількість загальних білків та об'ємна активність даного білка оцінюються на кожному етапі очищення. Зазвичай це фермент і його активність виражається в ферментативних одиницях. Інші одиниці можуть бути використані для визначення білків без ферментативної активності. Знаючи об'єм кожної фракції, концентрацію загального білка та об'ємну активність, стає легко побудувати таблицю очищення.
Значення в попередній таблиці можна отримати з наступними даними. Для кожної з фракцій, отриманих під час очищення, вимірювали об’єм і відбирали аликвоти для визначення загальної кількості білків та активності білка, який слід було виділити. Наприклад, гомогенат у таблиці має об’єм 150 мл і містить 4 мг білка/мл і 40 U ферменту/мл. Це забезпечує кількість загального білка (150 мл х 4 мг/мл = 600 мг загального білка), загальну активність (40 ОД/мл х 150 мл = 6000 ОД) і питому активність (6000 О ÷ 600 мг = 10 ОД/мг). Таким же чином отримуємо значення інших дробів. Тоді очищення та вихід можна легко визначити. Отже, для супернатанту ми можемо розрахувати очищення (25 Од/мг ÷ 10 ОД/мг = 2,5X) і вихід (3750 О ÷ 6000 ОД = 62,5%).
створення: 99 04 02
ЛІТЕРАТУРА І БІБЛІОГРАФІЯ
РФ Боєр (1986) Сучасна експериментальна біохімія, Addison-Wesley Publishing Co, Reading (Массачусетс, США), с. 243-52 (основні поняття щодо очищення: вибір методів, етапів, приготування сирого екстракту тощо), 252-64 (очищення лактального альбуміну) .
RL Сушарка, GF Lata (1989) Експериментальна біохімія, Oxford University Press, Нью-Йорк.
П Камун (1975) Апарати та методи в біохімії, Flammarion Médecine-Sciences, Париж,.
Дж. Клінг (1997) Вчені використовують різні методи боротьби з очищенням білка, The Scientist 11 [14]: 14-. [методи очищення білків, рекомбінантних чи ні, виражених у системах in vitro]
Мер Р. Шабо, Г. Ерве (1990) Модель дослідження: аспартаттранкармілаза, Массон, Париж.
Д.Т. Пламмер (1987) Вступ до практичної біохімії (3-е видання) Макгроу-Хілл, Лондон.
NC Price (1992) Методи вилучення ферментів в R Eisenthal, MJ Danson (eds), Enzymes assays, IRL Press, Oxford, pp. 255-76. [методи очищення білка з акцентом на ферменти]
Б Остерлунд, Дж. К. Янсон (1997) Стратегічний підхід до очищення білка: Частина 1, Pharmacia Biotech. 2 (3): 8-10. [опис стратегій очищення, способів зберігання]
К Вільсон, Дж. Уокер (1994) Принципи та методи практичної біохімії (4-е видання) Cambridge University Press. Оксфорд.