C-генотипуючий вірус гепатиту - Synevo

Загальна інформація та рекомендації

Вірус гепатиту С (ВГС) є патогеном із загальним поширенням та основною причиною захворюваності та смертності. Згідно з останніми оцінками, за останні 15 років серопродуктивність ВГС зросла до 2,8%, що еквівалентно> 185 мільйонам інфекцій у всьому світі. Постійна інфекція HCV пов’язана з розвитком цирозу печінки, гепатоцелюлярної карциноми та печінкової недостатності з високим рівнем смертності.

Як і інші РНК-віруси, ВГС має значне генетичне різноманіття на рівні нуклеотидів, що є основною проблемою як для розробки вакцин проти ВГС, так і для пангенотипової терапії.

На основі філогенетичного аналізу геномної послідовності штами ВГС в даний час класифікуються на 7 різних генотипів (ВГС 1-7), які відрізняються один від одного в послідовностях нуклеотидів на 30-35% та понад 50 підтипів, серед яких реєструє різницю 15-25%. Крім того, у заражених особин ВГС циркулює та поводиться як суміш різних вірусних популяцій, що називаються квазівидами 1; 2 .

Геном HCV складається з доменів, які сильно відрізняються за швидкістю мутацій та мінливістю послідовностей нуклеотидів. Таким чином, нетранслируемая область на 5 'кінці генома (5'UTR) є найкраще збереженим доменом з найменшою швидкістю еволюції. Далі слід ген С (серцевина), який кодує ядро нуклеокапсиду білка і який еволюціонує втричі швидше порівняно з 5'UTR-областю. Гени, що кодують білки оболонки Е1 та Е2, складають гіперваріабельну область, яка відрізняється від одного ізоляту до іншого. Це дозволяє вірусу обходити імунні механізми господаря, спрямовані проти доступних білків у оболонці вірусу. .

Згідно з останніми даними про загальну поширеність ВГС, генотип 1 є найбільш поширеним (46,2% усіх випадків ВГС-інфекції), а потім генотип 3 (30,1%); генотипи 2, 4 та 6 відповідають за 22,8% випадків, а генотип 5 - за 1 .

У нашій країні переважають генотип 1b та суміш генотипів 1a та 1b 4. Дослідження, проведене в Інституті Матея Балша в Бухаресті на 670 пацієнтах, показало 99,7% поширеність генотипу ВГС 15 .

Мета противірусної терапії - вилікувати ВГС-інфекцію. Стійкий вірусологічний відповідь (СВР) визначається невизначеною РНК ВГС через 12 та 24 тижні після закінчення лікування. ВІЛ-інфекція виліковується у понад 99% випадків, коли була отримана СВР. У пацієнтів без цирозу SVR, як правило, асоціюється з вирішенням захворювань печінки, тоді як у тих, хто страждає на цироз печінки, хоча фіброз печінки може регресувати, а ризик розвитку печінкової недостатності та портальної гіпертензії знижується, ризик гепатоцелюлярної карциноми не повністю усунений.

До 2011 року лікування базувалося на комбінації пегільованого інтерферону α та рибавірину, швидкість відповіді різнилася залежно від генотипу ВГС. При такому терапевтичному підході було отримано показник RVS приблизно 40% у Північній Америці та 50% у Західній Європі для генотипу 1 ВГС. Більш високі показники RVS (до 80%) були отримані для генотипів 2, 3, 5 та 6, тоді як для генотипу 4 проміжні норми RVS були отримані 6 .

На початку 2015 року Європейська комісія дозволила розміщення на ринку нового лікарського засобу - Viekirax + Exviera, і лікування було схвалено для прийому з рибавірином або без нього пацієнтам із хронічною інфекцією генотипу 1 гепатиту В, включаючи хворих із компенсованим цирозом печінки, хворих, котрі заражені ВІЛ-1, пацієнтам, які проходять лікування опіатної залежності, та пацієнтам, які отримують трансплантацію печінки. . Крім того, препарат був схвалений у комбінації з рибавірином для пацієнтів з хронічним генотипом 4. Гепатиту C. Вієкіракс складається з комбінації фіксованої дози парітапревіру 150 мг (інгібітор протеази NS3/4A) та ритонавіру 100 мг (інгібітор CYP3A4, що збільшує паритапревір) у комбінації з омбітасвіром 25 мг (інгібітор NS5A) один раз на день, а Ексвіера складається з дасабувіру 250 мг (ненуклеозидний РНК-залежний інгібітор РНК-полімерази), який вводять двічі на день з рибавірином або без нього . Ця комбінація вільних від інтерферону противірусних препаратів синергічно націлена на реплікацію ВГС на 3 різних рівнях. За результатами 6 досліджень фази III та 2 досліджень фази II загальний СВР за 12 тижнів для пацієнтів, інфікованих генотипом 1, становив понад 96% 6; 7 .

На закінчення рекомендується проводити генотипування ВГС при всіх інфекціях вірусу С перед початком будь-якого лікування, щоб вибрати відповідний протокол. .

Тест, проведений у нашій лабораторії, використовує методику RT-PCR (зворотна транскрипція цільової РНК з генерацією комплементарної ДНК, яка буде посилена реакцією ПЛР, з виявленням амплікону в реальному часі) та флуоресцентно мічені олігонуклеотидні зонди, специфічні для кожного генотипу, для ідентифікації генотипів ВГС від 1 до 6 та підтипи а та b генотипу 1 8 .

Зібраний зразок - венозна кров 8 .

Збиральний контейнер - пилосос, що містить ЕДТА як антикоагулянт 8 .

Необхідна обробка після збору врожаю - відокремити плазму центрифугуванням 8 .

Обсяг вибірки - мінімум 1 мл плазми 8 .

Стабільність зразка - зразки плазми стабільні протягом 1 місяця при -20 ° C 8 .

Метод - ПЛР у реальному часі на автоматичній платформі m2000 (Abbott); тест використовує в якості цілей ампліфікації послідовність з 5'UTR-ділянки вірусного геному для виявлення генотипів 1-6 та області NS5B для окремої ідентифікації підтипів 1a та 1b; Використовуються 4 набори праймерів, що вимагають 3 типів окремих реакцій:

реакція А: виявляє всі ізоляти ВГС, ізоляти підтипу 1а та ізоляти генотипу 3;
реакція В: виявляє ізоляти генотипу 2, підтипу 1b та генотипу 1;
реакція С: виявляє ізоляти з генотипами 4, 5 і 6.

Під час підготовки кожного зразка пацієнта вводиться послідовність РНК, не пов'язана з геномом ВГС, яка буде служити внутрішнім контролем на всіх стадіях процесу. Контрольні зразки (позитивні та негативні) також використовуються при кожному запуску зразків.

Точність тесту продемонстрували, проаналізувавши 162 ізоляти ВГС з генотипом 1 (110 з генотипом 1а та 58 з генотипом 1b), 41 ізольований генотип ВГС 2, 27 ізольований генотип ВГС 3, 28 ізольований генотип ВГС 4, 14 генотип ВГС 5 і 12 ізольованих генотипів ВГС 6. Метод секвенування нуклеїнових кислот був використаний для визначення еталонного генотипу в кожному аналізованому зразку. Відповідність двох методів (генотипування та секвенування ПЛР) становила 97,59% для всіх виявлених генотипів, 97,27% для підтипу 1a та 91,38% для підтипу 1b 8 .

Межі та перешкоди

Генотипування ВГС не рекомендується проводити для скринінгу або підтвердження ВГС-інфекції. Тест можливий лише за наявності вірусемії C> 500 МО/мл.

Олігонуклеотидний зонд, відповідний 5'UTR-області геному HCV генотипу 1, не перехресно реагує із зразками, що містять HCV підтипу 6a, але може виявляти перехресну реактивність з підтипом 6b та деякими нетипами 6a/6b підтипів генотипу 6.

У деяких випадках можуть бути отримані незрозумілі результати через неоднорідність послідовностей геному ВГС, змішані інфекції або (рідкісне) існування рекомбінантних штамів ВГС 8 .