Covid-19, як працюють тести та яке їх використання
Ерік Мурель, Вільний університет Брюсселя (ULB)
За оцінками, близько 20% осіб, інфікованих ГРВІ-CoV-2, протікають безсимптомно, але можуть поширювати хворобу. Отже, стратегія боротьби з пандемією Covid-19, яка потрясає наше суспільство, обов'язково вимагає посилення тестів для виявлення інфекції. Десятки мільйонів людей все ще потребують обстеження для стримування епідемії. Але також під час зняття з експлуатації, щоб не виникало нових спалахів епідемій.
Для досягнення цих цілей, швидше за все, буде потрібно поєднати два типи тестування. Тести на ідентифікацію осіб, що переносять вірус, та тести на ідентифікацію осіб, які розробили імунну відповідь проти вірусу. У поєднанні ці тести визначають три категорії осіб. Неінфіковані особи, які не виявляють вірусу чи імунної відповіді, і, отже, вони можуть заразитися в майбутньому. Інфіковані особи, позитивні на вірус, які можуть поширювати інфекцію, і тому їх слід ізолювати. І нарешті особи, які вже не заражені і мають антитіла проти вірусу. Теоретично вони повинні бути стійкими до інфекції, тому можуть циркулювати та перероблятись без ризику для себе та своїх близьких. Зауважте, що на цьому етапі якість та тривалість цього захисту невідомі.
У демократичному режимі необхідна підтримка масової стратегії тестування. Це членство вимагає, як мінімум, розуміння природи проведених тестів, їх переваг та меж.
Структура вірусу SARS-CoV-2
Генетичним матеріалом коронавірусу SARS-CoV-2 є позитивна одноланцюгова РНК (ssRNA). Ця РНК кодує чотири структурні білки: хребет (колосок, S), оболонка (оболонка, Е), мембрана (мембрана, М) та нуклеокапсид (нуклеокапсид, N).
Білок N безпосередньо пов'язаний з РНК. Білки S, E та M вставляються в ліпідний бішар і утворюють вірусну оболонку, що оточує комплекс N/ssRNA. Білок S відповідає за приєднання вірусу до клітин-господарів через рецептор АПФ2 (ангіотензинперетворюючий фермент 2). В основному це виражається в дихальних та травних шляхах.
Виявлення генетичного матеріалу вірусу
Реакція RT-PCR (ланцюгова реакція зворотної транскриптази-полімерази), яку зазвичай називають в середовищі ПЛР-тестом, нуклеотидним тестом або молекулярним тестом, дозволяє з неперевершеною специфічністю та чутливістю виявити наявність у біологічному зразку РНК вірусу. Цей тест був першим доступним для діагностики ГРВІ-CoV-2, оскільки його можна швидко розробити на основі послідовності вірусу.
РНК, присутня у зразку, спочатку повинна бути очищена додаванням різних розчинників. Цей етап екстракції, який закінчується ресуспендуванням РНК у воді, займає від однієї до двох годин. Сама RT-PCR складається з двох основних етапів. Спершу РНК повинна бути перетворена в ДНК за допомогою ферменту зворотної транскриптази (RT). Цей фермент бере РНК як шаблон для синтезу так званої комплементарної послідовності ДНК (кДНК). Якщо кДНК вірусу присутня у зразку, тоді сильно посилюється кількісною полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР). Ця реакція проходить у три фази. Денатурація кДНК нагріванням при 95 ° C для відокремлення двох ланцюгів, що її складають, гібридизація праймерів на кінцях бажаної послідовності, потім елонгація завдяки дії ферменту ДНК-полімерази при 58 ° C. Праймери - це одноланцюгові послідовності ДНК, специфічні для вірусу. Саме вони гарантують специфічність реакції ампліфікації. Ампліфікуються лише ланцюги кДНК, що зв'язують ці праймери. Тривалість циклу ПЛР становить близько однієї хвилини. Це повторюють 45 разів, щоб отримати експоненціальне множення цільової послідовності ДНК. Саме ця фаза посилення надає тесту RT-PCR дуже високу чутливість.
Однак цей тип тестування має кілька недоліків. Деякі реактиви є дорогими, і експоненціальне збільшення кількості випробувань призвело до їх нестачі. Тест повинен проводитися в лабораторії та вимагає складного обладнання, доступного в обмежених кількостях. Залежно від його автоматизації, це займає від трьох до шести годин (розпакування та маркування зразків, інактивація вірусу, вилучення РНК, RT-PCR, перевірка). Тому результат часто доступний лише протягом 24 годин.
Його надійність залежить від багатьох факторів. Якість зразка є критичною. Це слід робити досить глибоко в носових порожнинах пацієнта за допомогою великого ватного тампона, що вимагає хорошого контролю. Також було помічено, що вірус може бути не виявлений у верхніх дихальних шляхах, але присутній у легенях. Як результат, надійність тесту RT-PCR, незважаючи на дуже високу специфічність (~ 100%) та чутливість, оцінюється лише у 60-80% при ідентифікації інфікованої особи. Ця надійність з часом зменшується, оскільки вірус усувається за допомогою імунної відповіді. Це лише 40-50% між 15 і 39 днями після зараження. Цей відсоток може здатися низьким, але він подібний до показника тестів на виявлення RT-PCR на вірус грипу.
Виявлення білків вірусу
Для виявлення присутності вірусу також були розроблені швидкі тести, які не можна проходити в лабораторії безпосередньо на місцях (так звані тести Point-of-Care, POC).
Так звані тести "швидкого антигену" дозволяють виявити вірусні білки у людини за кілька хвилин. Зразки беруть з носових порожнин, як для тесту RT-PCR. Наявність вірусних білків демонструється за допомогою антитіл, специфічних для цих білків, у поєднанні з ферментом, що дозволяє колориметричну реакцію на вкладці, як для тесту на вагітність, доступного в аптеках.
Наприклад, тест POC цього типу нещодавно був розроблений компанією CorisBioconcept (Бельгія), що базується в Гемблуті, у співпраці з кількома лікарнями та університетами. Він отримав сертифікат відповідності Європейській фармакопеї (CEP).
На відміну від тестів RT-PCR, швидкі тести на антиген не мають фази посилення сигналу і виявляють вірус лише тоді, коли він присутній з високим титром. Тому вони менш чутливі та надійні, ніж тест RT-PCR для виявлення інфікованої особи. Ці тести вважаються швидкими діагностичними орієнтаційними тестами (TROD). У разі негативного результату доцільно підтвердити швидкий тест на антиген за допомогою тесту RT-PCR.
Виявлення імунної відповіді проти вірусу
У відповідь на інфекцію імунна система господаря виробляє специфічні антитіла проти білків вірусу. Деякі з цих антитіл перешкоджають приєднанню вірусу до клітин господаря і, як кажуть, нейтралізують.
Антитіла до вірусу присутні в крові заражених осіб. Їх можна виявити шляхом проведення імуноферментного аналізу. Білки рекомбінантних вірусів, синтезовані in vitro за допомогою генної інженерії, фіксуються на підставці і захоплюють специфічні антитіла, присутні в сироватці крові пацієнта. Потім наявність антитіл виявляється за допомогою ферментативної реакції, яка виділяє забарвлений компонент.
Ми можемо розрізнити тести типу ІФА (імуноферментний аналіз), що проводяться в лабораторії на класичному зразку крові (венозному). І тести POC шляхом уколу в пальці (відомий як укол пальцем). У випадку ІФА колориметричну реакцію вимірюють кількісно за допомогою спектрофотометра, що дозволяє точно дозувати антитіла. Це випадок з тестом німецької компанії EUROIMMUN. У разі тестів на укол пальця, таких як тест бельгійської компанії ZenTech, результат зчитується оком на вкладці.
Виробництво специфічних антитіл проти ГРВІ-CoV-2 виявляється в середньому від 10 до 20 днів після початку інфекції. Тому він надає історичну інформацію про інфекцію та дає можливість ідентифікувати осіб, які потенційно захищені від неї. Проте імунна відповідь дуже варіюється у людей, і хоча Китай успішно використовує тести на укол пальцем для боротьби з епідемією, нам все ще бракує уваги для оцінки надійності серологічних тестів цього типу на великій популяції. Крім того, важливо мати можливість виключити будь-яку перехресну реакцію цього тесту з імунною реакцією на 6 інших коронавірусів (HCoV-229E, HCoV-HKU1, HCoV-OC43, HCoV-NL63, SARS-CoV та MERS- CoV), який може заразити людей. Нарешті, було б корисно, щоб ці тести дозволили в довгостроковій перспективі розрізняти природно інфікованих осіб та осіб, які будуть щеплені. Тому особлива увага потрібна для розробки серологічних тестів.
Питання масштабної організації випробувань
На початок квітня 2020 року було проведено 78 тестів RT-PCR, 13 швидких тестів на антиген та 101 серологічний тест з маркуванням CEP. Тому зараз доступно багато тестів для виявлення присутності SARS-CoV-2, а також специфічної імунної відповіді на цей вірус. Вони являють собою недорогий спосіб зібрати багато інформації, необхідної для управління цією пандемією.
Жоден з цих тестів не є на 100% надійним, але при використанні кваліфікованим медичним персоналом та в поєднанні вони виявляють більшість інфікованих та імунних осіб. Швидкі та недорогі антиген POC та серологічні тести здаються особливо придатними для масового скринінгу. Вони могли частково замінити тести на виявлення вірусів методом РТ-ПЛР та серологічні тести методом ІФА, що проводяться в лабораторії.
Тому головним викликом ефективної боротьби з цією пандемією є організаційний характер. Кілька європейських держав законодавчо заборонили доступ до цих тестів особам. Вважалося, що проведення цих тестів неспеціалізованим користувачем може призвести до неправильного тлумачення стану пацієнта. З одного боку, кожен тест має певний рівень помилкових спрацьовувань та негативів. З іншого боку, кожен тест надає конкретну інформацію, яка вимагає контекстуалізації або результатів інших тестів для правильної інтерпретації. Тому випробування повинні проводити кваліфікований персонал, в лікарнях або на місцях, що створює багато логістичних проблем, вирішення яких є обов'язком держав.
Сінгапур, Тайвань і Гонконг вклали великі кошти в скринінгові тести, і їм вдалося стримати інфекцію та уникнути перенаселення лікарень, що значно зменшило смертність, пов'язану з інфекцією. На відміну від них, Європа та США явно не передбачали ризик. Лікарняна система в деяких країнах та регіонах була насичена драматичними наслідками. Тому, щоб вийти з цієї кризи згори, необхідно терміново проводити масові тести для забезпечення основних служб та регулярної оцінки рівня зараження, а також розвитку колективного імунітету серед населення.
Я хотів би подякувати Обердану Лео (ULB), Фаб'єну Андрісу (ULB), Філіпу Лефевру (ULB), Олів'є Денису (Sciensano) та Марті Романо (Sciensano) за їхні коментарі та пропозиції.