Делеція Tbc1d1 пригнічує ожиріння у лептинових дефіцитних мишей - Міжнародний журнал
предметів
реферат
Передумови:
Варіанти гена TBC1D1 пов'язані з ознаками ожиріння у деяких видів, включаючи людей, мишей, кроликів та курей. Хоча варіанти TBC1D1 пов'язані з ожирінням у людей, порушення гена Tbc1d1 зменшило масу тіла мишей. TBC1D1 визначено як регулятор інсулінозалежного транспорту глюкози в скелетних м'язах, але його роль в енергетичному гомеостазі в ожирінні залишається незрозумілою. Досліджено вплив дефіциту TBC1D1 на енергетичний гомеостаз, метаболізм глюкози та ліпідів у встановленій миші моделі ожиріння.
Методи:
Ожиріння лептину (ob/ob) та мишей із подвійною недостатністю Tbc1d1 (D1KO-ob/ob) генерувались шляхом схрещування надмірної ваги B6. V. Lep ob/ob миші з худими мишами з дефіцитом Tbc1d1 на фоні C57BL/6J. Мишей-самців, які отримували або стандартну дієту (SD), або дієту з високим вмістом жиру (HFD), оцінювали за вагою тіла, складом тіла, споживанням їжі, добровільними фізичними навантаженнями та витратами енергії за допомогою непрямої калориметрії. Проаналізовано толерантність до глюкози та інсуліну, а також транспорт глюкози та окислення жирних кислот у скелетних м’язах.
Результати:
У мишей із ожирінням дефіцит Tbc1d1 призвів до зниження ваги SD та HFD. Однак споживання їжі залишалося незмінним на SD або навіть збільшувалось у мишей з дефіцитом Tbc1d1, що годувались HFD, без будь-яких змін у добровільних фізичних навантаженнях. Незважаючи на суттєво зменшений стимульований інсуліном транспорт глюкози та посилене окислення жирних кислот в інтактних ізольованих скелетних м'язах, миші з дефіцитом Tbc1d1 із ожирінням не продемонстрували значних змін у глікемії та толерантності до глюкози порівняно з контролем ожиріння. Непряма калориметрія показала, що миші з дефіцитом Tbc1d1 з ожирінням мали знижений коефіцієнт дихання разом із збільшеними добовими витратами енергії.
Висновки:
У ожирених лептин-дефіцитних мишей дефіцит TBC1D1 не впливає на поведінку годування або споживання енергії, але призводить до збільшення витрат енергії, зміни переваги енергетичного субстрату з підвищеним окисленням жирних кислот та придушення ожиріння. TBC1D1 може грати еволюційно збережену роль у регуляції енергетичного гомеостазу у хребетних.
вступ
Матеріали та методи
матеріалів
Людський рекомбінантний інсулін (Actrapid HM Penfill) був придбаний у Novo Nordisk Pharma GmbH, Майнц, Німеччина, а AICAR (карбоксамід рибонуклеотид аміноімідазолу) придбаний у Enzo Life Sciences, Лоеррах, Німеччина. Радіохімікати були отримані від Hartmann Analytic, Брауншвейг, Німеччина ([1- 14 C] -D-манітол, 0,1 мКі мл -1) та від American Radiolabeled Chemicals, Сент-Луїс, Міссурі, США ([9, 10 (n) - 3 H] пальмітинова кислота, 1 mCi мл -1; 2- [1,2, 3 H (N)] дезокси-D-глюкоза, 1 mCi мл -1.
Покоління огрядних тварин з дефіцитом Tbc1d1
Генотипування
Геномну ДНК із кінчиків хвоста миші виділяли за допомогою InViSorb Genomic DNA Kit II (Invitek, Берлін, Німеччина). Мишей генотипували для Tbc1d1 (D1KO-Fwd: 5'-CAA-CAT-TCT-GAA-GGC-CTT-CTG-3 ', D1KO-Rev: 5'-TCC-CTG-ACA-AGC-TGA-GT- 3 '; WT-Fwd: 5'-GGA CAA GCA GCTT TCT TGT TT-3', WT-Rev: 5'-TCC TGG TCC AGA AGC GAG-3 ') та для паралельного (Fwd: 5'- TGT CCA AGA TGG ACC AGA CTC-3 '), Rev: 5'-ACT-GGT-CTG-AGG-CAG-GGA-GCA-3').
Вилучення РНК та синтез кДНК
РНК екстрагували з різних тканин миші за допомогою QIAzol та RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Німеччина) відповідно до рекомендацій виробника. КДНК транскрибували з 2 мкг загальної РНК, використовуючи GoScript Reverse Transcriptase (Promega, Mannheim, Germany) та випадкові гексамери P (dN) 6 (Roche, Mannheim, Germany).
Кількісна ПЛР в режимі реального часу
Кількісну ПЛР у реальному часі проводили за допомогою зондів TaqMan (Applied Biosystems, Фостер-Сіті, Каліфорнія, США) для Tbc1d1 (Mm00497989_m1), PrlR (Mm00599957_m1) та для Actb (FAM-TTG AGA CCT TCA ACA CCC CAG CCA-TAMRA) . MWG, Ebersberg) як ген ведення домашнього господарства. Аналізи проводились за допомогою Швидкої ПЛР-системи в реальному часі 7500 від Applied Biosystems (Прикладні біосистеми). Дані нормалізували за методом ΔCt шляхом віднімання значення Ct бета-актину від значення Ct цільового гена. 16
Аналіз маси тіла, складу і довжини тіла
Загальну масу тіла аналізували за допомогою електронних ваг (Sartorius, Геттінген, Німеччина). Склад тіла (жир і худою масу тіла) визначали за допомогою ядерно-магнітно-резонансного спектрометра (ЯМР-аналізатор Bruker-Minispec mq10, Bruker Optics, Еттлінген, Німеччина). Довжину тіла аналізували, вимірюючи довжину від носа до заднього проходу.
Глюкоза, тести на толерантність до інсуліну
Після голодування протягом ночі тварини отримували через зонд пероральний болюс глюкози (2 г на кг маси тіла, 20% розчин). Зразки крові відбирали з кінчика хвоста в різний час (0, 15, 30, 60 і 120 хвилин), а рівні глюкози та інсуліну визначали, як описано нижче. Для тесту на толерантність до інсуліну мишам голодували протягом ночі і внутрішньочеревно вводили 2 МО інсуліну на кг маси тіла. Глюкозу в крові визначали через 0, 15, 30 і 60 хвилин після ін’єкції.
Параметри крові
Цукор у крові визначали за допомогою глюкометра (Contour, Bayer, Leverkusen, Німеччина). Інсулін у плазмі крові вимірювали методом ІФА (Insulin Mouse Ultrasensitive ELISA, Alpco, Salem, MA, USA), плазмовими кетоновими тілами за допомогою автомобільного комплекту Total Ketone Bodies, вільним жиром, кислотами за допомогою системи NEFA-HR 2 (обидва Wako Chemicals, Neuss, Німеччина ). Адипонектин аналізували за допомогою мишачого адипонектинового набору ELISA (Millipore, Billerica, MA, США), адипоцитокіни IL-6, MCP-1, PAI-1 та резистину аналізували за допомогою Milliplex MAP Kit, мишачої сироватки Adipokine (Millipore) та IGF -1 із системою розробки DuoSet ELISA (R & D Systems, Ебінгтон, Великобританія). Тригліцериди та вільний гліцерин визначали за допомогою набору для визначення тригліцеридів у сироватці крові (Sigma-Aldrich, Steinheim, Німеччина). Всі параметри плазми визначали, як описано виробником.
Аналіз поглинання глюкози та окислення жирних кислот в ізольованих скелетних м'язах
Мишам знеболювали і ретельно розтинали м’язи розгиначів пальців довжини та підошви на задніх лапах. Інкубаційне середовище складається з бікарбонатного буфера Кребса-Генселейта, доповненого 5 мМ HEPES та 0,1% бичачого сироваткового альбуміну без жирних кислот. Інкубацію проводили на водяній бані (30 ° С) при безперервному виділенні газу (95% O 2/5% CO 2) і обережному перемішуванні. Для визначення поглинання глюкози м’язи довжини розгинача пальців інкубували протягом 30 хвилин з 5 мМ глюкозою і 15 мМ манітолом у відсутність або присутність 120 нМ інсуліну. Після остаточної інкубації з 1 мМ [3 Н] 2-дезокси-глюкози (2,5 мКі мл -1) та 19 мМ [14 С] маніту (0,7 мКі мл -1) протягом 20 хвилин, м'язи негайно знаходились у рідкий азот і лід зберігаються в замороженому стані при -80 ° C. Для визначення швидкості окислення жирних кислот м'язи підошви інкубували в бікарбонатному буфері Кребса-Генселейта, що містить 5 мМ глюкози, 15 мМ манітолу, 3,5% безжирної бичачої сироваткової альбуміну, 4 мКі мл -1? 3 H] пальмітат і 600 мкМ містили немічений пальмітат з 2 мМ AICAR або без нього при 30 ° C протягом 120 хвилин, а радіоактивність вимірювали сцинтиляційним підрахунком середовища.
Непряма калориметрія
Коефіцієнт дихання та аналіз ЕЕ описані в іншому місці. 7 Коротше кажучи, тварини пройшли фазу адаптації за 24 години до вимірювання. Клітки поміщали в кліматичну камеру при 22 ° C, а споживання кисню (VO 2) та вироблення вуглекислого газу (VCO 2) контролювали протягом 23 годин при швидкості потоку
Корм-напій
Споживання їжі та фізичну активність контролювали за допомогою автоматизованої системи аналізу TSE (тип 302015-c/32, TSE Systems, Бад-Хомбург, Німеччина). Тварини мали вільний доступ до корму та води, а датчики ваги на кормових кошиках реєстрували кількість корму, спожитого кожною твариною. Фізичну активність визначали за допомогою інфрачервоних датчиків.
Вестерн-блот-аналіз
Тригліцериди печінки
Тканину печінки гомогенізували в 10 мМ фосфатному буфері натрію з 1% поліоксиетилен-10-тридецилетаном і 1 мМ ЕДТА з використанням тканинного лізера (Qiagen). Гомогенат інкубували протягом 5 хв при 70 ° С і центрифугували протягом 10 хв при 16000 об. Тригліцериди печінки вимірювали у надосадовій рідині за допомогою набору (TRIGS) (Randox, Crumlin, UK), як описано в посібнику.
Тканинний глікоген
Тканини гомогенізували в 1 М КОН, інкубували протягом 30 хв при 70 ° С і нейтралізували концентрованою оцтовою кислотою. Додавали амілоглюкозидазу (Sigma-Aldrich) і зразки інкубували протягом ночі при 37 ° С. Після центрифугування (10 хв, 2000 ККД) глюкозу в надосадовій рідині вимірювали глюкозою Liquicolor (Human, Taunusstein, Німеччина) відповідно до рекомендацій виробника.
Результати
Видалення Tbc1d1 призводить до значного зменшення маси тіла у мишей із ожирінням
Маса тіла та склад тіла мишей WT та D1KO ob/ob. ( a ) Вага тіла, ( ) Загальна маса жиру в організмі та ( c ) Нежирна маса тіла самців мишей WT та D1KO-ob/ob, виведених на SD або HFD. Дані представляють середні значення ± sem; n = 17-30 (SD) і n = 6-23 (HFD); * P −1 на 24 год ± 0,054 кДж g −1 на добу) 24 год; D1KO-ob/ob: 1,44 кДж g -1 за 24 год ± 0,09 кДж g -1 за 24 год). Під час годування HFD кількість споживаної їжі значно збільшувалася у більш худих мишей D1KO-ob/ob порівняно з тваринами WT-ob/ob (WT-ob/ob: 1,32 кДж g −1 за 24 год ± 0, 054 кДж) g -1 за 24 год; D1KO-ob/ob: 1,63 кДж g -1 за 24 год ± 0,087 кДж g -1 за 24 год; P = 0, 00015). Крім того, аналіз споживання їжі у молодих 7-тижневих мишей показав схожі результати без суттєвих відмінностей у тварин, що харчуються SD, і збільшення споживання їжі у мишей D1KO-ob/ob, дефіцитних Tbc1d1, дефіцитних Tbc1d1 (додатковий малюнок 2г). .
Вживання їжі та фізична активність мишей WT та D1KO ob/ob. ( a ) Тканинний розподіл TBC1D1 у 16-тижневих самців мишей WT-ob/ob, проаналізованих за допомогою вестерн-блот. ( ) Експресія Tbc1d1 у різних ділянках мозку мишей із ожирінням WT та D1KO-ob/ob, а також у нежирних мишей WT-ob/+ та в скелетних м'язах (М. quadriceps) мишей WT та D1KO-ob/ob, які були проведені аналізували кількісну ПЛР у режимі реального часу з бета-актином як геном ведення домашнього господарства. Експресія Tbc1d1 нормалізувалась до експресії мишей WT в скелетних м'язах. Мишам було 16 тижнів і годували СД; Дані представляють середнє значення ± sem; n = 6-10. ( c ) Споживання корму, виміряне протягом 24 годин, з урахуванням загальної маси тіла та ( d Добровільна фізична активність, що аналізується за допомогою інфрачервоного випромінювання у 15-тижневих мишей-самців, виведених з SD або HFD. Дані представляють середні значення ± sem; n = 5-11; * P −1 ± 0,032 кДж g −1; D1KO- об/об: 2,78 кДж g −1 ± 0,032 кДж g −1; P = 0,009) (Рисунки 3c - d).
Глікемічний контроль мишей WT та D1KO-ob/ob. ( a ) Глюкоза в крові мишей самців 17 тижнів у стані після їжі на SD або HFD. ( ) Глюкоза в крові мишей-самців 12 тижнів, яких годували SD, і ( c ) відповідний рівень інсуліну в плазмі крові під час перорального ГТТ з 2 г глюкози на кг ( d ) Глюкоза в крові мишей-самців 14 тижнів, виведених на СД з 2 МО інсуліну на кг під час внутрішньочеревного тесту на толерантність до інсуліну. Дані представляють середні значення ± sem; n = 5-9; * P 3 H] 2-дезокси-глюкоза в скелетних м'язах аналізується, як описано. Як показано на фіг. 5а, обидві групи з дефіцитом лептину показали знижене споживання глюкози при стимуляції інсуліном порівняно з худими контрольними тваринами WT-ob/+ (WT-ob/ob: 4,63 нмоль мг -1 за 20 хвилин ± 0,40 нмоль мг -1 на добу) 20 хв; WT-ob/+: 6,09 нмоль мг -1 за 20 хв ± 0,039 нмоль мг -1 за 20 хв; Р = 0,079). Однак миші D1KO-ob/ob продемонстрували суттєво знижене споживання глюкози, стимульоване інсуліном, порівняно з мишами WT-ob/ob (WT-ob/ob: 4,63 нмоль мг -1 на 20 хв ± 0,40 нмоль мг -1 на 20 хв; D1KO-ob/ob: 3,26 нмоль мг –1 на 20 хв ± 0,19 нмоль мг –1 на 20 хв; P = 0,0019).
Однак вплив підвищеного окислення жирних кислот на розвиток маси тіла є суперечливим. У двох незалежних дослідженнях на мишах Acc2 -/- було висловлено припущення, що для збільшення ЕЕ та зменшення маси тіла достатньо більшого припливу жирних кислот у мітохондрії. 21, 22 В одному з цих досліджень було показано, що миші Acc2 -/- мають знижений рівень малоніл-КоА і, отже, посилене β-окислення в скелетних м’язах. 21 У другому дослідженні автори спостерігали збільшення ЕЕ та зменшення маси тіла у мишей Acc2 -/- і прийшли до висновку, що ці ефекти можуть бути безпосередньо пов’язані зі збільшенням надходження жирних кислот та подальшим збільшенням окислення в мітохондріях . 22 На відміну від цього, нещодавнє дослідження на мишах Acc2 -/-, проведене Hoehn та його колегами 23, не виявило змін в ЕЕ чи вазі тіла, припускаючи, що посилене β-окислення може бути недостатнім для пояснення ефекту придушення ожиріння. Миші з дефіцитом лептину та Tbc1d1.
Ожиріння корелює зі зниженням чутливості до інсуліну, і навпаки, слід очікувати, що зменшення вмісту жиру в організмі призводить до збільшення чутливості до інсуліну. 24 Хоча миші з дефіцитом Tbc1d1 і D1KO-ob/ob з меншим вмістом загального жиру в організмі, ніж контролі, були значно нижчими, рівень цукру в крові не знижувався. Крім того, ні толерантність до глюкози, ні чутливість до інсуліну у цих мишей суттєво не змінилися, що вказує на те, що зниження викиду глюкози в скелетних м’язах мишей з дефіцитом Tbc1d1 D1KO-ob/ob компенсувало сприятливий ефект придушення ожиріння на глікемію у цих мишей. може.
Мутації TBC1D1 також пов'язані з контролем маси тіла у людей. Два дослідження показали зв'язок між кодуючим варіантом R125W та індексом маси тіла (ІМТ) у жінок, сприйнятливих до ожиріння, тоді як однонуклеотидні поліморфізми TBC1D1 у чоловіків та жінок EPIC Потсдам виявили сильну зв'язок з ІМТ та обхватом талії. стала когортною. 10, 11, 25 Відповідні дослідження на тваринах на свинях, кроликах та курах виявили зв'язок між варіантами TBC1D1 та складом тіла та ожирінням. 12, 13, 14, 15 Наше дослідження, проведене на ожирених мишах, свідчить про те, що TBC1D1 відіграє еволюційно збережену роль у регуляції маси тіла та складу хребетних. Молекулярна основа цього спостереження та можливий еволюційний вибір варіантів TBC1D1 потребують подальшого дослідження.