Дієтичне годування з високим вмістом жиру та аналіз триацилгліцеридів з високою пропускною здатністю на Drosophila Melanogaster
Резюме
Це протокол дієтичного харчування з високим вмістом жиру, який використовується для індукування ожиріння у дрозофіли, моделі для розуміння основних молекулярних механізмів, причетних до ліпотоксичності. Він також пропонує аналіз триацилгліцеридів з високою пропускною здатністю для вимірювання накопичення жиру у дрозофіли та, можливо, інших моделей (комах) за різних дієтичних, екологічних, генетичних чи фізіологічних умов.
Анотація
Хвороби серця є основною причиною смерті людини у всьому світі. Численні дослідження показали сильний зв’язок між ожирінням та серцевими розладами у людей, але для кращого з’ясування механізмів потрібні додаткові інструменти та дослідження. Вже більше століття дуже слухняна генетично модель дрозофіли сприяє відкриттю ключових генів і молекулярних сигнальних шляхів, які, як було показано, високо зберігаються поза межами видів. Багато біологічних процесів і механізмів захворювань функціонально зберігаються в льоту, таких як розвиток (наприклад, план тіла, серце), рак та нейродегенеративні захворювання. Нещодавно дослідження ожиріння та вторинних захворювань, таких як серцево-судинні захворювання у модельних організмів, зіграло дуже важливу роль у визначенні основних регуляторів, що беруть участь у метаболічному синдромі у людей.
Тут ми пропонуємо використовувати цей модельний організм як ефективний засіб для стимулювання ожиріння, тобто тобто використовувати надмірне накопичення жиру та розробити ефективний протокол для контролю вмісту жиру у вигляді накопичення TAG. На додаток до високозбереженого, але менш складного геному, муха також має короткий термін життя для швидких експериментів, поєднаних з економією. У цій статті наведено докладний протокол для харчування з високим вмістом жиру (HFD) при дрозофілі, ожирінні та аналізі триацилгліцеридів з високою пропускною здатністю (TAG) для вимірювання відповідного збільшення вмісту жиру з метою стимулювання відтворюваності та ефективності для великих генетичний або хімічний скринінг. Ці протоколи пропонують нові можливості для ефективного вивчення механізмів регулювання, пов’язаних із ожирінням, а також забезпечують стандартизовану платформу для досліджень щодо виявлення наркотиків для швидкої оцінки впливу кандидатів на наркотики на розвиток або профілактику ожиріння, діабету та метаболічних захворювань.
Вступ
Сама їжа HFD складається зі стандартної їжі для мух, доповненої кокосовою олією, складається переважно з насичених жирів, які, як відомо, пов'язані з метаболічним синдромом 18. Хоча ожиріння у моделей ссавців, таких як гризуни, може зайняти індукційні місяці 19, 20, наш оптимізований протокол HFD при годуванні дрозофілою ефективно і відтворюється збільшує вміст жиру в організмі за кілька днів 12, 14. Цей протокол, у поєднанні з високопродуктивним аналізом TAG, дозволяє ефективно проводити масовий скринінг на вплив генетичних факторів, впливів навколишнього середовища та кандидатів на наркотики, щоб виявити нові модулятори ліпідного обміну. Як результат, ці протоколи повинні розуміти та/або боротися із захворюваннями людини із зайвою вагою та ожирінням.
Протокол годування є універсальним і може використовуватися для вивчення метаболічних та функціональних ефектів будь-яких насичених або ненасичених жирних кислот. Застосування високопродуктивних аналізів TAG не обмежується D. melanogaster, але може бути адаптовано до різноманітних малих модельних організмів з кутикулами або твердими позаклітинними матриксами (наприклад, інші види дрозофіл, C. elegans та інші модельні безхребетні) вміст жиру для вимірювання в різних екологічних, генетичних та фізіологічних умовах на будь-якій стадії розвитку, дорослому віці або стадії метаболічного захворювання. Аналіз TAG заснований на колориметричному вимірі серії ферментативних реакцій, які розкладають TAG на вільні жирні кислоти, гліцерин, гліцерин-3-фосфат і, нарешті, H2O2, який отримують з 4-аміноантипірином (4-AAP) та 3,5- дихлор-2-гідроксибензолсульфонат (3,5 DHBS) реагує, утворюючи продукт червоного кольору, який вимірюють за допомогою 96-лункового спектрофотометра.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
1. Протокол подачі HFD
Ця таблиця узагальнює різні інгредієнти, які використовуються для підготовки нашого контролю. Після формування 10 мл їжі розливають у флакони, охолоджують та зберігають при 4 ° C для тривалого зберігання.
ілюстрація 1 . Харчування HFD у дрозофіли.
Схема показує різні етапи годівлі для мух контрольною їжею (звичайний раціон без додавання кокосової олії NF) або HFD (з додаванням кокосової олії). Весь процес займає 10 днів після першого збору дорослих. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
У D. Melanogaster, як і у випадку з іншими видами, спостерігається статевий диморфізм між самцями та самками 22. Відомо, що самки більші, з більшою кількістю жиру в животі, ніж самці 22. Щоб перевірити ефективність нашого протоколу, ми використовували тести TAG, щоб визначити різницю вмісту TAG між стандартними лабораторними чоловічими та жіночими мухами дикого типу (ш 1118). Дані показують, що жінки мають більше всього жиру в організмі, ніж їхні чоловіки (рис.2A, B). Дані також показали, що аналізи є стабільними, без змін у кількісному вимірі TAG з часом (до 50 хв після інкубації) і без коливань залежно від розміру біологічної проби (3 або 5 мух).
Встановлено, що споживання HFD викликає ожиріння у людей та мишей 19, 20, 23. Щоб перевірити ефективність нашого протоколу годівлі, ми використовували аналізи TAG з нашими HFD та контролювали годували самок мух. Ми виявили, що споживання HFD у дрозофіли спричиняло підвищений вміст жиру, який з часом поступово накопичувався (рис.3A-C). Інша важлива знахідка полягає в тому, що лише після 18 годин годування HFD (рис. 3C.), нам вдалося спричинити значне збільшення вмісту жиру у цих мух. Ці результати свідчать про те, що ця система генетичної моделі є ідеальним інструментом для прискорених досліджень з метою пошуку нових регуляторів ожиріння, спричиненого HFD.
Малюнок 2 . Аналізи TAG у чоловічих і жіночих мух.
Двотижневих мух у звичайному харчуванні збирали, групували за статтю (самці та самки), зважували та мели (3 або 5 мух на лунку) для аналізу TAG. Аналізи TAG проводили відповідно до процедур, описаних у цьому документі. Поглинання кожної проби при 550 нм зчитували в різні моменти часу (0 хв, 5 хв, 20 хв і 50 хв) для визначення будь-яких коливань кількісної оцінки TAG, зчитування з плином часу, зміни вмісту жиру в різних розмірах популяції (3 і 5 мух) w 1118 мух та відмінності між вмістом TAG у чоловіків та жінок. Результати показали, що жінки мали більше жиру, ніж їхні чоловіки (А.-B.) накопичуються, вимірювання TAG не коливаються до 50 хв після інкубації реакції при 37 ° C (А.-B.). Навіть середні рівні TAG залишаються незмінними між тестами TAG на 3 або 5 мух (А.-B.). Дані представлені як середнє значення ± статистика SEM: суттєвої різниці немає. Будь ласка, натисніть тут, щоб отримати більшу версію цього малюнка.
Малюнок 3 . Впливає на накопичення жиру HFD.Від: Збирали 2-тижневих жіночих мух, піднятих до нормального рівня або рівня HFD протягом 5 днів, та проводили аналізи TAG для визначення жиру. Вміст TAG був зважений (А.) або рівень білка (B.) нормалізований. Дані показали, що споживання HFD призводить до підвищення рівня жиру за допомогою обох методів нормалізації. C: Двотижневі самки мух на нормальній/контрольній їжі (NF) та 18 год, 1 день або 2 дні на HFD досліджуються на вміст TAG. Результати показують помітне і поступове збільшення рівнів TAG з 18 годин до 2 днів впливу HFD. Дані представлені як середнє значення ± статистика SEM: t-тест Стьюдента. * p Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Індукція ожиріння у мишей може зайняти 19, 20 місяців. У мух цей протокол годівлі HFD дозволяє викликати надмірне накопичення жиру протягом декількох днів або менше, викликаючи збільшення накопичення жиру лише після 18:00 (див. Малюнок 2). Харчування HFD за описаним протоколом збільшує або зменшує вміст глюкози 12, Bmm ліпази та експресію 24 PGC-1. Це на відміну від дрозофіли натще у дорослих, яка спричинила швидке зменшення вмісту жиру та глюкози 25, 26 та збільшення експресії Bmm 24. Він також підвищує рівні Bmm або PGC-1 для захисту ожиріння, спричиненого HFD, 14, 24. Незважаючи на те, що в цьому протоколі було використано 30% HFD, літайте з ожирінням, спричиненим годуванням 3%, 7% або 15%, у режимі дозозалежного режиму харчування 12, наприклад, збільшуючи тривалість годування HFD (Рисунок 3). Ми також виявили, що окремі жирні кислоти були основними компонентами кокосової олії, тобто тобто годування 14% лауринової кислоти або 5% міристинової кислоти спричиняє суттєве збільшення накопичення жиру 12 .
Прискорена метаболічна реакція цих мух на терапію ВЧС корелює зі зменшеною тривалістю життя 27, як це спостерігається у ссавців 28, але спостерігається> 80% мух виживають протягом 20 днів на ВЧС 27. Швидка індукція накопичення жиру, опосередкована збереженими клітинними та молекулярними процесами метаболізму ліпідів та глюкози, є корисною для багатьох досліджень ожиріння, таких як: B. Діабетична або ліпотоксична кардіоміопатія 10, 12, 13, 14, 15, 16. Важливе розуміння наслідків метаболічного дисбалансу та пов’язаних з цим серцевих дисфункцій, ймовірно, дасть можливість порівняльних поступальних досліджень у людей.
Протокол годівлі HFD сумісний для використання з іншими видами дрозофіл та моделями комах, які мають подібні дієти з D. melanogasters. Ці протоколи живлення HFD можуть бути відповідно адаптовані для організмів, таких як C. elegans або навіть інших комах, які потребують інших "нормальних" харчових середовищ. 30% HFD не придатний для використання в експериментах, що вимагають високих температур; Однак менші концентрації кокосової олії або окремих жирних кислот можуть бути адекватними альтернативами 12 .
Ожиріння, метаболічний синдром та пов’язані із ним захворювання завжди є найвищими з катастрофічним впливом на здоров’я людини 1, 2. Комбінований протокол HFD та аналіз TAG з високою пропускною здатністю забезпечують унікальну платформу для використання модельних організмів, таких як дрозофіла, для швидкого викликання ожиріння та виявлення генетичних факторів або використання природних та синтетичних хімічних сполук для кращого розуміння метаболічного дисбалансу. Зрештою, це могло б суттєво сприяти прогресу наукових знань для розробки нових методів лікування або засобів проти метаболічних захворювань.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.