Диференціація функціональних ролей експресії генів від імунних та неімунних клітин миші

Резюме

Трансплантація кісткового мозку пропонує спосіб змінити генотип клітин, отриманих з кісткового мозку. Якщо ген, що представляє інтерес, експресується як на клітинах, отриманих з кісткового мозку, так і на клітинах, що не походять з кісткового мозку, трансплантація кісткового мозку може змінити клітини, отримані з кісткового мозку, на інший генотип, не генотипуючи клітини, що не походять з кісткового мозку.

Анотація

Протокол

А. Технічні міркування перед початком роботи

* Короткий опис протоколу випробування наведено в ілюстрація 1 показано.

2. Опромінення приймачів мишей

  1. Мишей розводять і містять у пристрої для збудників хвороб. Помістіть мишей в автоклавний опромінювальний пиріг з фільтрами. Помістіть мишку в кожне проріз опромінювального пирога. Поставте торт у центр уваги та переконайтеся, що вертушка та торт обертаються.
  2. Увімкніть повітряний насос для вентиляції. Закрийте дверцята обігрівача і зафіксуйте їх.
  3. Опромінюйте мишей 1000 радів (що еквівалентно 10 Гр) протягом приблизно 10 хв (залежно від джерела випромінювання та періоду напіввиведення). З цього моменту опромінені миші страждають імунітетом і мають слабкий імунітет до інфекції. Після опромінення вийміть торт і помістіть у стерильний контейнер для транспортування до шафи з біобезпеки тварин. Уникайте потрапляння мишей у зовнішнє середовище, щоб мінімізувати ймовірність зараження.
  4. У шафі з біобезпеки переведіть мишей в автоклавні клітини для мишей з автоклавованими грядками (4 миші на клітку. Нова стерильна вода із суспензією сульфатриму - 3,12 мл на 100 мл води).
  5. Оберніть пляшку з водою алюмінієвою фольгою, оскільки антибіотики чутливі до світла. Перед тим, як помістити його в клітку, добре струсіть пляшку сульфатриму з сумішшю.

3. Екстракція кісткового мозку донора

4. Підрахунок клітин-донорів кісткового мозку

  1. Додайте 100 мкл трипанового синього в пробірку Еппендорфа і 100 мкл суспензії кісткового мозку в пробірку Еппендорфа і перемішай. Піпеткою перефарбуйте суміш клітин у лічильну камеру.
  2. Кількість клітин розраховується із загальної площі життєдіяльності клітин кісткового мозку в сокольних трубках = кількість незабарвлених клітин у 16 ​​квадратах x 2 (завдяки розведенню трипанового синього) x 10000 x 50 мл
  3. Центрифугуйте клітини кісткового мозку у 50 мл сокольних пробірках при 2000 об/хв протягом 5 хв при 4 ° C.
  4. Видаліть супернатант. Виходячи із загальної кількості клітин, змініть розмір гранули з PBS до 1 х 10 8 клітин на мл

5. Настій мишам-реципієнтам

  1. Розігрійте мишей-одержувачів на грільній панелі та під тепловою лампою. Помістіть мишей-реципієнтів у фіксатор. 1 × 10 7 клітин на мишу по 100-200 мкл внутрішньовенно.
  2. Ін'єкція донорського кісткового мозку повинна проводитися між 4-24 годинами після опромінення.
  3. Дотримуйтесь 4 введених мишей в клітку. Утримуйте введених мишей-реципієнтів в автоклавованих клітках водою, обробленою антибіотиками, протягом перших 4 тижнів у тваринництві, що не містить патогенів, і дозволяйте мишам відновити імунітет. Міняйте клітини, воду та їжу, оброблену антибіотиками, кожні 4 дні, щоб дотримуватися гігієни.

6. Індукція коліту та оцінка коліту

7. Перевірка якості трансплантації кісткового мозку з використанням проточної цитометрії

  1. Позначте кожну пробірку зразків крові або кісткового мозку №1-5:
  2. Приготуйте суміш антитіл для кожної відповідної пробірки в темряві.

# 1 Без антитіл
# 2 30 мкл контролю ізотипу FITC + 30 мкл контролю ізотипу PE + 15 мкл блокування CD16/32
# 3 блокування 30 мкл FITC CD45.1 Ab + 15 мкл CD16/32
# 4 блокування 30 мкл PECD45.2 Ab + 15 мкл CD16/32
# 5 блокування 30 мкл FITC CD45.1 Ab + 30 мкл PE CD45.2 Ab + 15 мкл CD16/32

Не додайте нічого до зразка крові або кісткового мозку №1
Додайте 5 мкл суміші антитіл №2 до кожного зразка крові або кісткового мозку №2
Додайте 3 мкл суміші антитіл №3 до кожного зразка крові або кісткового мозку №3
Додайте 3 мкл суміші антитіл №4 до кожного зразка крові або кісткового мозку №4
Додайте 5 мкл суміші антитіл №5 до кожного зразка крові або кісткового мозку №5
  1. Тримати в темряві на льоду 30 хв.
  2. 2 мл 1X буфера лізису еритроцитів у кожну пробірку. Тримати в темряві на льоду 15 хв.
  3. Центрифугуйте клітини при 1500 об/хв, 5 хв при 4 ° C. (ротор GH 3,8, 1500 об/хв = 350 xg) Видаліть супернатант. Гранула з 500 мкл клітинного буфера для фарбування в темряві, потім ненадовго вихрово.
  4. Перевірте CD45.1 (еквівалент WT) та CD45.2 (KO) у імунозабарвлених зразках крові та кісткового мозку за допомогою проточної цитометрії. Виберіть FITC, щоб представляти WT CD45.1, а PE - KO CD45.2.
  5. Проаналізуйте результати проточної цитометрії за допомогою програмного забезпечення FlowJo. Обчисліть співвідношення співвідношення FITC: PE або співвідношення PE: FITC, щоб визначити, чи домінуючі генотипи донорів у крові та кістковому мозку.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Репрезентативні результати

Якщо цікавить ген відіграє значну роль в імунних клітинах при розвитку коліту, миші, які отримують кістковий мозок різного генотипу шляхом трансплантації кісткового мозку (WT KO або KO до WT), повинні мати змінену відповідь на коліт DSS. Одним з найважливіших параметрів при визначенні тяжкості коліту є фарбування H&E тканин товстої кишки. Зміни структури тканини товстої кишки та ознаки запалення можуть бути оцінені кількісно за допомогою системи оцінки гістології H&E. Критерії оцінки гістології H&E для моделі коліту DSS можна знайти тут 2. В якості альтернативи, хімічно індукований коліт також може бути викликаний тринітробензолсульфоновою кислотою (TNBS). Методи індукції коліту TNBS та критерії оцінки гістології H&E можна знайти в попередній публікації 3. Гістологічна різниця балів між групами, проаналізованими студентськими t-тестами.

У мишей може бути значно покращений або погіршений коліт у мишей з підробленою трансплантацією кісткового мозку (WT WT або KO KO). Якщо цікавить ген відіграє значну роль при коліті через клітини, отримані з кісткового мозку, миші з обмінним кістковим мозком повинні реагувати суттєво інакше, ніж миші з підробленою трансплантацією кісткового мозку.

Для моделі коліту DSS зміна гістології може бути оцінена шляхом оцінки гістології (див Малюнок 4). Значні зміни в гістологічному рейтингу можуть бути зумовлені утворенням коліту, опосередкованого геном, що представляє інтерес, у клітинах, отриманих з кісткового мозку. Наприклад, кателізидин є антимікробним та протизапальним геном пептиду (ген, що представляє інтерес у нашому випадку) 4. Без трансплантації кісткового мозку у нокаутованих мишей з кателицидином зазвичай розвивався гірший коліт, ніж у мишей дикого типу у відповідь на DSS. Переливання мишей з нокаутом кателіцидину (KO) кісткового мозку дикого типу призводить до поліпшення коліту, тоді як переливання кісткового мозку мишам з нокаутом кателіцидину (KO) мишам дикого типу (WT) призводить до погіршення коліту, коли DSS (Малюнок 2) піддається.

Для підтвердження експресії гена, що представляє інтерес, слід виявити експресію мРНК гена, що представляє інтерес (наприклад, кателізидин) з донорського кісткового мозку дикого типу в товстій кишці (або іншій) тканини мишей-реципієнтів з дефіцитом кателізидину після трансплантації кісткового мозку. Цікаво також знати, чи експресія цікавого гена у мишей-реципієнтів дикого типу зменшувала кістковий мозок після донорства від нокаутованих мишей.

Успішна трансплантація кісткового мозку донора представлена ​​домінуючим співвідношенням ізотипу донорського CD над ізотипом CD реципієнта як у клітинах периферичної крові, так і в кістковому мозку мишей-реципієнтів. Кістковий мозок найкраще показує мічення CD45.1 та CD45.2 у проточній цитометрії, оскільки в крові багато незабарвлених клітин (Малюнки 2 і 3).

ролей
Рисунок 1. Експериментальний протокол трансплантації кісткового мозку.

ролей
Рисунок 2. Дані проточної цитометрії для мишей-реципієнтів кісткового мозку після трансплантації кісткового мозку. Вісь Y показує сигнал CD45.1, позначений FITC, а вісь X - сигнал CD45.2, позначений PE. Успішна трансплантація кісток визначається зміною генотипу CD45.1 або CD45.2 як у кістковому мозку, так і в крові мишей-реципієнтів. Клацніть тут, щоб побачити більше зображення .

експресії
Рисунок 3. Дані проточної цитометрії від мишей-реципієнтів після трансплантації кісткового мозку. Вісь Y показує сигнал CD45.1, позначений FITC, а вісь X - сигнал CD45.2, позначений PE. Успішна трансплантація кісток визначається зміною генотипу CD45.1 або CD45.2 як у кістковому мозку, так і в крові мишей-реципієнтів. Клацніть тут, щоб побачити більше зображення .

ролей
Рисунок 4. Оцінка коліту у мишей після трансплантації кісткового мозку. (A) Зразки H&E зображень товстої кишки через нормальну гістологію та коліт DSS. (B) Бали гістології. Успішна індукція коліту DSS може бути підтверджена значним збільшенням показника гістології до 5-го дня лікування DSS. Після обміну кісткового мозку на інший генотип бал гістології повинен суттєво змінитися. Це свідчить про змінений перебіг коліту, спричиненого вираженням гена, що цікавить клітини кісткового мозку. Дані представлені як середнє значення ± стандартне відхилення середнього значення.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Обговорення

Цей підхід до трансплантації кісткового мозку підходить для імунологічних досліджень коліту, інфекцій, раку, ожиріння та інших захворювань. Цей експеримент з трансплантації кісткового мозку необхідний, коли ген, що представляє інтерес, виражається як у клітинах кісткового мозку, так і в клітинах, що не походять з кісткового мозку, і, як представляється, ген, що представляє інтерес, опосередковує захворювання клітинами будь-якої популяції. Наприклад, показано, що протимікробний пептид кателізидин модулює гострий коліт. Але він експресується як в епітеліальних клітинах, так і в імунних клітинах (макрофагах). Потім ми маємо кісткові трансплантати, щоб визначити, яка популяція клітин модулює гострий коліт у мишей. Тяжкість коліту суттєво змінилася після зміни генотипу кателізідіну кісткового мозку шляхом трансплантації кісткового мозку. Тоді ми можемо зробити висновок, що кателізідін, експресований у клітинах кісткового мозку, відіграє значну роль у модуляції гострого коліту у відповідь на DSS.

З іншого боку, існує багато способів відстеження успіху трансплантації кісткового мозку. Аналіз проточної цитометрії генотипів CD45.1 та CD45.2 може бути кількісним методом для визначення частки донорських стовбурових клітин кісткового мозку у мишей-реципієнтів. Отримані з кісткового мозку клітини можна диференціювати на кілька типів клітин 10. Якщо аналіз проточної цитометрії неможливий, можна використовувати мишей-донорів-самців (хромосома XY) та мишей-реципієнтів самок (XX-хромосома). Миші-донори несуть унікальні Y-хромосоми в тілі XX-х самок мишей-реципієнтів. Y-хромосому можна ідентифікувати за допомогою флуоресценції in situ гібридизації 11. Крім того, для візуалізації клітин, отриманих з кісткового мозку донора, може знадобитися імуногістохімія CD45.1, CD45.2 та/або ген, що цікавить тканини.

Але проточний цитометричний аналіз CD45 та процедури гібридизації in situ хромосоми in situ зазвичай проводять після вбивства мишей. Для того, щоб відстежувати положення донорських клітин у мишей-реципієнтів, що використовуються для моніторингу хронічних захворювань, таких як рак, не проводячи обстеження мишей, можна використовувати трансгенних мишей зеленого флуоресцентного білка як мишей-донорів 12. Отже, клітини, отримані з донорської кісткової клітини, можна простежити в тілі мишей-реципієнтів за допомогою неінвазивної оптичної візуалізації високої роздільної здатності під тимчасовою анестезією, і це можна робити неодноразово.

Не всі миші мають успішну трансплантацію кісткового мозку 13. Ми спостерігали,

10-20% мишей гине від анемії або інфекції в перші 2 тижні після опромінення. Тому на початку експерименту слід зробити більше мишей, ніж потрібно. Наприклад, слід підготувати 10 мишей на групу на початку експерименту, якщо ви очікуєте 8 мишей на групу до кінця експерименту з колітом. Отже, переконайтеся, що ви вилучили загиблих мишей якомога швидше. Швидкість відновлення імунної системи корелює з кількістю гемопоетичних стовбурових клітин у кістковому мозку, введених мишам-реципієнтам 14. Тому критично важливо мати достатню кількість живих клітин кісткового мозку (1 x 10 7 клітин на мишу), що вводяться мишам-реципієнтам для успішної трансплантації кісткового мозку.

Миші-одержувачі після опромінення порушували імунітет. Процедури дисекції донорських мишей та підготовки кісткового мозку слід проводити за тим самим стандартом, що і експерименти з культурою клітин. Використовуючи стерильні інструменти та контейнери, слід застосовувати асептичні умови. У всіх експериментах PBS містить 1% пеніцилін-стрептоміцину та 10 ОД/мл гепарину, який слід використовувати при обробці кісток садової гарбуза. Всі реагенти призначені для культури клітин. Подальше технічне обговорення можна знайти в посиланні 13.

Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.

Розкриття інформації

Жодних конфліктів інтересів не заявлено.

Подяка

Ця робота була профінансована за рахунок пілотного гранту з техніко-економічного обґрунтування від Центру UCLA-CURE, Фонду хвороб Крона та Коліту Америки (№ 2691) та Національного інституту охорони здоров’я NIDDK K01 (DK084256) для фінансування Hon Wai Koon.

Хірургію опромінення кісткового мозку підтримали Бернард Левін та Скотт Кухня з Центру досліджень СНІДу UCLA Миша/Хімера людини. Операція проточної цитометрії підтримувалась системою Vector Core від UCLA.