Динаміка та агрегація білків, що каталізуються, регулюють функції білка. Суспільство Макса Планка
Біокаталіз
Рис. 1: Неактивна цистеїнова протеаза AvrRpt2 із шприців Pseudomonas активується пептидил-проліл-цис/транс-ізомеразою ROC1 із Arabidopsis thaliana. Обидва білки утворюють комплекси Майкеліса, в яких AvrRpt2 є субстратом для ROC1 і в яких каталітичний процес призводить до збільшення швидкості оборотної цис/транс-ізомеризації критичного пептидного зв’язку пролілу.
Вчені, які працюють з Гунтером Фішером, виявили протеолітичну реакцію, в якій має бути можливим порівняти збільшення ланцюгової динаміки неактивної протеази з активацією функції протеази в присутності пептидного зв'язку-цис/пер-Корелятна ізомераза. Ця реакція діє як сигнальний шлях імунної відповіді рослини на зараження бактерією Pseudomonas syringae відомі. Неактивна цистеїнова протеаза AvrRpt2 передається рослині, кресовій стінці, через систему секреції бактерій III типу Arabidopsis thaliana, контрабандою. ROC1, прототипний пептидил-проліл-цис/пер-Ізомераза в Арабідопсис, потім активує протеолітичну функцію AvrRpt2 таким чином, що певні білки стійкості тепер можуть стати ефективними (Рис. 1).
Рис.2: Активація протеазної функції неактивної цистеїнової протеази AvrRpt2 з Pseudomonas syringae досягається за допомогою ROC1, прототипового циклофіліну з Arabidopsis thaliana. Як показують профілі ВЕРХ реакційних сумішей, фрагмент AvrRpt272-255 (1,0 мкМ) може розірвати пептидний зв’язок Gly-Gly у фторогенному олігопептиді Abz-IEAPAFGGWy-NH2 (y = 3-нітротирозин) навіть під час дуже тривалої інкубації (255 год) при кімнатній температурі не розщеплювати (С). ROC1 (10 мкМ) також також неактивний (B). Однак, якщо обидва білки змішуються з олігопептидом в партії інкубації, майже повне споживання субстрату можна побачити вже через кілька секунд (пік через 23,3 хв) (А). Два продукти розщеплення Abz-IEAPAFG-OH (пік при часі утримування 17,2 хв; MW 822,9 г/моль; m/z 823,2) та H-GWy-NH2 (пік при часі утримування 15,2 хв, MW 468,4 г/моль; m/z 469,1) є результатом каталізованого гідролізу зв’язку Gly-Gly. Також показано пік CypA.
Ці дослідження вперше доводять, що локальне збільшення динаміки основного ланцюга може спонукати білок звільнити раніше приховану здатність, тут протеолізу субстрату. У той же час стає ясно, що цей механізм відіграє роль не тільки в пробірці, але і в живій клітині, напр. Б. в імунній відповіді рослин на бактеріальні інфекції. В даний час вчені знаходяться в процесі ідентифікації проліну, відповідального за активацію AvrRpt2 у його амінокислотній послідовності, та отримання висновків про структуру та динаміку відповідних комплексів Michaelis за допомогою ЯМР-досліджень (співробітники: Корделія Шиєне-Фішер, Крістіан Люкке, Гюнтер Яхрейс).
хвороба Альцгеймера
Хвороба Альцгеймера є найпоширенішою причиною деменції в Німеччині. Імовірно, в основі захворювання лежить утворення волокнистих білкових відкладень - так званих амілоїдних фібрил. При хворобі Альцгеймера ці волокна складаються з пептиду Aβ. Однак цілком ймовірно, що не фібрили є вирішальним пусковим фактором хвороби, а їх структурні попередники, які відбуваються як проміжні стадії в процесі формування. Тим часом вдалося виділити декілька з цих проміжних етапів складання та дослідити їх біохімічно. На електронних мікрофотографіях можна побачити як маленькі сферичні структури, так звані олігомери, так і більші волокнисті стани, які відомі як протофібрили (Рис.3). На додаток до їх морфологічної форми, точна молекулярна структура цих проміжних продуктів залишалася прихованою протягом тривалого часу. Разом з робочими групами в Магдебурзі, Лейпцигу та Єні Маркусу Фендріху зараз вдалося отримати детальну інформацію про структуру цих олігомерних та протофібрилярних проміжних продуктів.
Зображення електронного мікроскопа амілоїдних фібрил (зліва) та різних проміжних сполук, таких як протофібрили (посередині) та олігомери (праворуч). Шкала масштабування відповідає 200 нм.
Робота над структурою протофібрилярних та олігомерних проміжних продуктів стала можливою завдяки тому, що різні проміжні стадії могли стабілізуватися протягом досить тривалого часу за допомогою відповідних процесів, роблячи доступними біофізичні методи дослідження. У випадку протофібрилярних проміжних стадій це було досягнуто завдяки попередній випадковій знахідці. Робоча група з'ясувала, що виділений ним фрагмент антитіла здатний втручатися в конкретний етап у процесі складання та запобігати перетворенню проміжних проміжних проміжних речовин у амілоїдні фібрили. Таким чином, протофібрили Aβ можуть бути піддані більш поглибленому структурному дослідженню за допомогою так званої твердотільної ядерно-магнітно-резонансної спектроскопії. Цей спектроскопічний метод дозволяє спостерігати окремі атоми в молекулі та їх хімічне середовище.
Фендріх та його команда з'ясували, які структурні елементи стабілізують проміжні стадії складання та чим вони відрізняються між собою та від дорослих амілоїдних волокон на різних проміжних стадіях. Було виявлено, що проміжні продукти - подібні до амілоїдних фібрил - мають β-листкову структуру, але це влаштовано інакше порівняно з пізнішими стадіями складання. Ідентифікація стабілізуючих елементів в амілоїдних проміжних продуктах є важливою передумовою для розвитку цілеспрямованих інгібіторів, які перешкоджають утворенню таких структур. Тому у своїй постійній роботі група розробляє методи на основі пептидів для втручання в механізм утворення нейротоксичних білкових структур. Перші результати є багатообіцяючими і свідчать про токсичний нейтралізуючий ефект. У довгостроковій перспективі сподіваємось отримати нові точки атаки або цільові структури для розвитку терапії.
Шаперони PDI та клітинні білки
ERp46 відрізняється від ERp29 тим, що він може виконувати каталітичну функцію в окисно-відновних реакціях. При різних концентраціях глюкози він по-різному експресується в β-клітинах острівців Лангерганса в тканині підшлункової залози, і він також може служити для контролю сигналів адипонектину. Різниця у властивостях зв'язування для ERp29 та ERp49 очевидна у вищезазначених пептидних бібліотеках. З цього було зроблено висновок, що ERp46 може взаємодіяти з ERp29 у двох різних точках. Для кращого розуміння цих взаємодій молекулярно кристалізувався третій домен ERp46 (домен a´). У цьому контексті цікаво, що у мишей з дефіцитом ERp29 ERp46 регулюється, і водночас білки, що контролюють метаболізм жирних кислот, також впливають. Щоб перевірити ці взаємозв'язки, нокаутованих мишей ERp29 піддавали дієті з високим вмістом жиру та аналізували на здатність засвоювати глюкозу з крові (Рис. 4г). У той час як миші дикого типу демонстрували значно знижений профіль поглинання, що характерно для непереносимості глюкози при цукровому діабеті, значний поліпшений профіль виявлений для нокаутованих мишей ERp29 (P.