Дослідження синдрому фенілкетонурії у матері на мишах пропонують можливий підхід для одного

• предметів
• реферат
• фон
• Методи
• Результати
• Висновок
• Головна
• Методи
• Ретроспективний клінічний огляд записів
• Тварини, догляд та процедури
• ПЕГильована рекомбінантна Phe аміачна ліаза
• Аналіз Phe
• Аналіз амінокислот
• Фармакодинамічне моделювання
• Результати
• Материнська ФКУ: досвід медичного коледжу Флоридського університету
• Пегваліаза та миша ФКУ
• обговорення
• Додаткова інформація
• Документи Word
• Додаткова інформація
• Додаткові методи
• Додаткова фігура S1
• Додатковий малюнок S2
• Додаткова таблиця S1
• Файли Excel
• Додаткові таблиці

предметів

• Біологічна терапія
• Ендокринна система та метаболічні захворювання
• Дитячі дослідження
• Перебіг вагітності

реферат

фон

Нелікована фенілкетонурія (ФКУ), одне з найпоширеніших генетичних захворювань у людей, зазвичай призводить до інтелектуальних вад. Хоча штучне харчування на основі білків може запобігти затримці, дотримання дієти часто погане у дорослих. У вагітних жінок ФКУ недотримання може призвести до синдрому ФКУ матері, при якому високий рівень фенілаланіну (Phe) спричиняє важкі ускладнення плода. Замісна терапія ферментами аміачної ліази (PAL) коригує ФКУ у мутантних мишей BTBR Phe-гідроксилази (Pah enu2), припускаючи можливе лікування синдрому материнської ФКУ у людей.

Методи

Ми розглянули клінічні дані, щоб оцінити частоту розвитку синдрому ФКУ у вагітних жінок ФКУ. Ми обробляли самок мишей ФКУ (на звичайній дієті) PAL, стабілізували Phe на фізіологічних рівнях і спарювали їх для оцінки результатів вагітності.

Результати

Медичні дані показують, що ефективність дієти для профілактики синдрому ФКУ у матері, на жаль, не суттєво покращилася з часу появи проблеми вперше 40 років тому. Лікування PAL вагітних мишей PKU показує, що потомство матерів, які отримували PAL, доживає до дорослого віку, на відміну від загальної летальності, що спостерігається у нелікованих мишей, або зниженого рівня виживання у мишей на дієті PKU.

Висновок

Лікування PAL зменшило тяжкість материнського синдрому ФКУ у мишей і може мати вплив на терапію ФКУ людини.

Плід, що розвивається у матерів з погано контрольованою ФКУ, може негативно позначитися на внутрішньоутробному впливі підвищеного рівня Phe. Спільне дослідження з питань фенілкетонурії матері показало, що підвищений рівень Phe у крові матері є тератогенним (5, 6, 7, 8, 9). Діти з синдромом ФКУ матері страждають на мікроцефалію, черепно-лицьовий дисморфізм, низьку вагу при народженні, вроджені вади серця, затримки розвитку та інтелектуальні вади (10, 11, 12). У 1980 р. 95% матерів із 524 вагітностями у 155 жінок з концентрацією Phe у крові ≥ 1200 мкМ мали принаймні одну психічно інвалідну дитину (13). Частота інтелектуальних вад, мікроцефалії та вроджених вад серця була набагато частіше, ніж серед загальної популяції, і корелювала з концентрацією Phe у крові матері.

Миша PKU є встановленою моделлю для ПКК людини і має клінічні характеристики, подібні до таких у пацієнтів ФКУ, включаючи гіперфенілаланемію (вихідні концентрації Phe у плазмі крові від 1000 до 2000 мкМ), гіпопігментацію, когнітивні дефекти, аудіогенні напади та синдром ПКУ у матері (21, 22). . У попередніх дослідженнях одноразове щотижневе підшкірне введення пегваліази у дозах 80 мг/кг мишам самців ПКУ знижувало рівень Phe у плазмі крові на ≤ 1200 мкМ у мишей-носіїв enu2 (HET) та гомозиготних BTBR протягом періоду до 10 місяців Мутантні миші Pahenu2 (PKU) (21) спочатку були з лабораторій Джексона (Bar Harbor, ME). Всі протоколи були схвалені Університетом Флориди IACUC. Мишам не дозволяли лікувати пегваліаз, і пегваліаз вводили підшкірно у верхню частину спини та нижню частину шиї. Плазмовий Phe отримували з 45. l зразок крові, зібраний у гепаринізованій мікрокапілярній пробірці.

ПЕГильована рекомбінантна Phe аміачна ліаза

ПЕГильована, рекомбінантна форма пегваліази Anabaena variabilis була надана компанією BioMarin Pharmaceutical (Новато, Каліфорнія). Стерильний розчин 10 мг/мл (

12 МО/мл) пегваліазу розводили до 5 мг/мл щотижня і зберігали при 0 ° С. Аліквоти розводили до 0,5–2,0 мг/мл, залежно від бажаної дози, і вводили 10 мкл/г маси тіла.

Аналіз Phe

Плазмовий Phe визначали за допомогою флуорометричного аналізу (24), який був широко модифікований для невеликих обсягів, швидкого часу обертання та форма мікропланшетного титра. Плазму з зразків крові заморожували до аналізу. Аліквоту (7,5 мкл) кожної проби плазми звільняли від білків, поміщали в 96-лункову ПЛР-тарілку з аналітичним коктейлем та інкубували протягом 2 годин при 60 ° С. Мідний реагент додавали в кожну лунку 0,5-міліметрової 96-лункової флуориметричної пластини (Nunc, Роскільде, Данія, критичне для точного визначення плазми Phe) і додавали зразки інкубованої плазми. Пластина знаходилась на зчитувачі планшетів SpectraMax M2 (Molecular Devices, Саннівейл, Каліфорнія) з параметрами збудження: 378 нм; Випромінювання: 512 нм.

Аналіз амінокислот

Поодинокі амінокислоти та стандарти (Sigma) та високоефективні рідинні хроматографічні реагенти (Fisher) були отримані від Sigma Chemical (Сент-Луїс, Міссурі) та Fisher Scientific (Атланта, Джорджія). Зразки плазми депротеїнізовані та доданий норлейцин як внутрішній стандарт. Висушені зразки дериватизували фенилтиокарбамилом, висушували у вакуумі, видаляли надлишок реагенту та хроматографували на ЖК Beckman System Gold з детектором UV-VIS (254 нм) та аналітичною колонкою C18 зворотної фази Phenomenex. Концентрації амінокислот розраховували, використовуючи стандартні/внутрішні стандартні площі піків порівняно із зразками піків.

Фармакодинамічне моделювання

Фармакокінетичні параметри визначали на основі однодозових фармакокінетичних/фармакодинамічних досліджень (Musson та Laipis, дані не наведені) у наївних мишей. Зразки плазми аналізували на рівень пегваліази за допомогою BioMarin Pharmaceutical, використовуючи пегваліаз-специфічний сендвіч-ферментний імуноферментний аналіз. Зв’язану пегваліазу виявляли за допомогою антитіл проти ПЕГ. Межа кількісного визначення становила 60 нг/мл. Рівні Phe у плазмі визначали, як описано вище. Концентрації плазми Phe у плазмі при різних режимах дозування пегваліази моделювались за допомогою програмного забезпечення WinNonlin версії 5.2 (Certara, Princeton, NJ, USA).

Результати

Материнська ФКУ: досвід медичного коледжу Флоридського університету

Медичний коледж Університету Флориди, кафедра педіатрії, кафедра клінічної генетики та метаболізму, обслуговує регіон Північної Флориди від Пенсаколи до Джексонвіля до Орландо. Це університетський медичний центр, який лікує більшість пацієнтів з ФКУ в районі від їх розладів. Вагітні жінки ФКУ отримують пренатальні консультації та інтенсивну харчову терапію через ризик для плода. Хоча відстань до центру робить регулярні візити незручними для багатьох пацієнтів, їх постійно консультують щодо дієти та просять щотижня подавати значення Phe крові та масу тіла. Наші рекомендації вагітним (і, можливо, вагітним) жінкам ФКУ мають підтримувати рівень Phe в крові від 120 до 240 мкМ і Tyr вище 50 мкМ, дотримуватися рекомендованого споживання поживних речовин під час вагітності та сприяти відповідному збільшенню ваги.

Ми ретроспективно вивчили записи 28 вагітностей між 1996 і 2010 рр. Пацієнти були розділені на три групи:

Група 1: Відмінний контроль Phe (3/28) - Середні значення Phe в крові під час вагітності були нижче 360 мкМ, з максимальними значеннями нижче 420 μM Phe в будь-який момент часу і щонайменше шість значень Phe, зареєстрованих у першому триместрі.

Група 2: Прикордонний контроль Phe (11/28) - Середній рівень Phe в крові був нижче 420 µ у першому триместрі. М, а потім у другому і третьому триместрах в середньому нижче 360 мкм. М. Пацієнтки з початковим значенням Phe у плазмі 700 мкМ або менше у першому триместрі та двома або менше значеннями вище 500 мкМ протягом решти вагітності.

Група 3: Неадекватний контроль Phe (14/28) - середні рівні Phe у плазмі були вище 420 мкМ у першому триместрі, середні показники перевищували 360 мкМ протягом решти вагітності та/або з множинними значеннями вище 420 мкМ.

Середні значення Phe протягом 40 тижнів вагітності для трьох когорт пацієнтів наведені на додатковому малюнку в Інтернеті S1. Результати кожної вагітності, класифікованої як нормальна або уражена, виходячи з параметрів народження (ваги, зросту, окружності голови), наявних даних клінічного обстеження та наявності станів, пов'язаних із синдромом ФКУ матері, зведені в Додаткову таблицю S1. Існують суттєві відмінності між групами (абсолютна величина Phe, досягнутий рівень контролю, максимальні значення Phe, зафіксовані протягом кожного інтервалу часу та результати вагітності); Детальний опис кожної групи можна знайти у файлі "Додатковий клінічний результат".

Пегваліаза та миша ФКУ

Щоб оцінити потенційну терапевтичну користь пегваліази у лікуванні вагітних жінок ФКУ та їх плодів, що перебувають у групі ризику розвитку ФКУ у матері, ми дослідили його вплив на синдром материнської ФКУ у мишей самки ФКУ із застосуванням різних доз та схем лікування. Результати наших досліджень зведені в таблицю 1; Детальні результати кожного дослідження наведені в додатковій таблиці S2. Тут ми зазначаємо, що синдром PKU у матері значно важчий у мишей з PKU, ніж у пацієнтів з PKU у людини. Повна смерть новонародженого протягом перших 24 годин життя є звичайним результатом (21). Крім того, хоча дієта з обмеженим вмістом Phe може частково виправити синдром PKU у матері у мишей PKU, небагато цуценят виживають після відлучення від їжі з низьким вмістом Phe (21).

50 г, а споживання їжі буде більш ніж удвічі більше. Прийом їжі нормалізується після народження, але знову збільшується під час годування груддю, оскільки годуюча мати годує від 40 до 50 г цуценят через 14 днів після народження, коли щенята починають пробувати тверду їжу. Ці фактори вказували на те, що схеми дозування двічі на тиждень, що застосовуються у дорослих невагітних мишей, не забезпечували належного підтримання стабільних фізіологічних рівнів Phe у плазмі під час вагітності.

Спочатку ми підозрювали, що рівень Phe у плазмі матері у дослідженні 08-005 міг досягти екстремальних значень, як занадто низьких, так і занадто високих для виживання цуценят, таких як дослідження обмеженого харчування Phe та коротке дослідження пегваліази. Період напіввиведення (21, 23). Відповідно, вісім самок мишей ФКУ (дослідження 08-027) послідовно обробляли протоколами пегваліази, розробленими шляхом фармакодинамічного моделювання, щоб отримати середній рівень Phe у плазмі 250 мкг. М при 4 мкм M (таблиця 1 та додаткова таблиця S2). Хоча остаточний протокол (понеділок, середа, 10 мг/кг; п’ятниця, 20 мг/кг) привів до чудового фізичного стану та збільшення тривалості життя, розмір посліду та кількість живих щенят зросли лише незначно (середній розмір посліду 6 (2 посліди з 10) цуценята при народженні); 32% вагітних відлучених цуценят) були помічені. Ці жінки були значно старшими на момент спарювання внаслідок коригування протоколу, необхідного для досягнення бажаного рівня Phe у плазмі крові на 4 години (табл. 1).

У третьому дослідженні (09-068a) 12 самок мишей ФКУ отримували дещо інший режим дозування (пегваліаза 10 мг/кг, понеділок, 8:00 ранку; середа, п’ятниця, 16:00 вечора), завдяки чому фармакодинамічне моделювання також призвело до рівномірного введення плазми Phe повинен забезпечувати контроль (рисунок 1 і таблиця 1). Крім того, зразки плазми брали о 8 ранку замість 16 години. Ці 12 мишей ФКУ мали в середньому 300 мкг. Рівень M Phe на рівні 4 мкм М, що вказує на хороший контроль рівня Phe протягом тижня, як передбачалося фармакодинамічним моделюванням. Однак значення у 8-годинних пробах крові різко збільшились (рис. 1). Ці жінки були спаровані під час цього протоколу дозування та мали загалом 39 вагітностей (Таблиця 1, Додаткова таблиця S2). Трохи більше 50% цих вагітностей мають відлучених цуценят із середнім розміром посліду близько шести цуценят (п'ять послідів з восьми або більше цуценят), що краще, ніж попередні результати.

Щоденні зміни в плазмі рівня фенілаланіну (Phe) у мишей, які отримували пегваліазну фенілкетонурію (PKU). Дванадцятьм самкам мишей ФКУ (Дослідження 09-068a) вводили підшкірно пегваліазу 10 мг/кг тричі на тиждень (понеділок, 8:00; середа, 16:00; п’ятниця, 16:00; ↓). Фармакодинамічне моделювання цього плану доз (▪▪▪▪) передбачало хорошу регуляцію рівнів Phe у плазмі. Зразки крові (40 мкл) відбирали о 8:00 ранку та 16:00 вечора в різні дні тижня протягом 7 тижнів, а рівні плазмофа в середньому отримували для отримання складеного щотижневого графіку рівня плазмофа (О). Основні хешові позначки для осі х представляють дні тижня (12:00 вечора), а вторинні хешові позначки для 8:00 ранку та 16:00 вечора Складені дані необроблених самок мишей ФКУ (2, •) повторювали сім разів, щоб продемонструвати максимальну узгодженість із щотижневими даними Phe плазми від лікування пегваліазою. Піки Phe у плазмі спостерігаються у оброблених тварин у часи, які відповідають максимальним рівням Phe у плазмі у нелікованих мишей PKU, хоча помітне зниження значень Phe у плазмі 8-AM у дні після введення пегваліази Доза спостерігається.

Щоденні коливання рівня фенілаланіну (Phe) у плазмі у нелікованих мишей жіночої фенілкетонурії (PKU). Зміна рівнів Phe в плазмі, що відбулася протягом 24-годинного циклу темного світла, була визначена на основі аналізу складених даних. Зразки крові (40 мкл) відбирали у шести дорослих самок мишей ФКУ у зазначений час, причому проби відбирали протягом 9 тижнів, щоб уникнути стресу через крововтрату. У кожної тварини за кожен момент часу відбирали по дві проби. Результати Phe плазми об'єднували та усереднювали, щоб отримати 24-годинний складний запис даних. Графік показує швидке збільшення понад 1000 мкМ у плазмі Phe, яке сталося, коли миші прокинулись о 18:00 і почали годуватись, і повільніше падіння від початку світлового циклу о 6 ранку.

Інший фактор може вплинути на лікування синдрому ФКУ матері з пегваліазом. У випадку необробленої ФКУ людини співвідношення Tyr до Phe часто знижується, спостережувані рівні Tyr у плазмі знижуються до 50% від значень, що спостерігаються у звичайних контролях (25). Ми вимірювали рівні Trp, Tyr та Phe у WT, PKU та мишей, оброблених пегваліазою PKU, за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (рис. 4). Як і у пацієнтів з ПКК у людини, рівень плазмового тиру в плазмі крові у мишей ФКУ знижувався з нормальних рівнів без будь-яких змін рівня Trp. Зниження рівня Phe плазми PKU до фізіологічного або субфізіологічного рівнів за допомогою пегваліази не впливало на рівень Tyr у плазмі крові. Спроби підвищити рівень Tyr у обробленої пегваліазою ФКУ миші шляхом додавання Tyr у питну воду були безуспішними через її погану розчинність. Тому використання штучної дієти з додаванням Tyr (де низька розчинність не обмежує потенційне поглинання) необхідне для визначення можливої ​​ролі низького Tyr у частковій відповіді синдрому PKU матері у миші PKU.

Рівні ароматичних амінокислот у плазмі самок мишей дикого типу (WT) та фенілкетонурії (PKU). Зразки плазми, отримані від необроблених мишей WT та PKU та оброблених пегваліазою мишей PKU, аналізували методом високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ). Зразки плазми у необроблених мишей ФКУ демонструють суттєво підвищений рівень фенілаланіну в плазмі та на 40–50% нижчий рівень тирозину у плазмі порівняно з мишами з ВТ. Рівні триптофану в плазмі залишались однаковими між двома генотипами. Лікування пегваліазом знижувало рівень плазмового Phe до фізіологічних або нижче нормальних фізіологічних значень залежно від режиму дозування. Рівні тирозину та триптофану у нелікованих та пегваліазових мишей ФКУ мишей були подібними.

обговорення

---