Двовимірний гель-електрофорез - біологія

двовимірний гель-електрофорез або 2D гель-електрофорез є аналітичним методом у біохімії, молекулярній біології та протеоміці. Він був розроблений в 1975 році О'Фарреллом [1] та Клозе [2] самостійно. Він поєднує ізоелектричне фокусування (IEF) з електрофорезом у поліакриламідному гелі SDS (SDS-PAGE), щоб розділити складні білкові суміші (бактеріальні лізати, лізати з вищих клітин або тканин, рідини організму) на окремі білки. Особливо висока роздільна здатність досягається поєднанням двох методів ортогонального розділення.

Кожна пляма на білковому малюнку відповідає типу (виду) білкових молекул. Оскільки білкові структури в біологічних системах змінюються залежно від середовища та стану, їх можна використовувати для розрізнення пошкоджених та здорових або оптимально та неоптимально вирощених клітин. Наприклад, вони надають інформацію про причини хвороби або механізм дії ліків на молекулярному рівні. Через складність двовимірних білкових зразків для їх оцінки використовуються спеціально розроблені комп’ютерні програми.

Підготовка зразка

Зразок отримують та обробляють у максимально однакових умовах. Це виключає можливість фальсифікуючих впливів на зразок на додаток до експериментальних змінних, що підлягають дослідженню. Білки в основному випадають в осад з позаклітинних середовищ існування (секретуються білки). Внутрішньоклітинні білки витягуються, обережно руйнуючи клітинні структури. Поза природного середовища білки особливо чутливі до утворення агрегатів та деградації протеазами. Крім того, підготовка зразків працює близько до 0 ° C. Як правило, додають сечовину та неіоногенні миючі засоби, а також інгібуючі протеазу речовини, щоб уникнути взаємодії та зміни білків.

Перший вимір (IEF)

Під час IEF (перший вимір) білковий екстракт одновимірно відокремлюється в гелі з градієнтом рН в електричному полі. Кислі та основні амінокислотні залишки білків переживають різні стани (де) протонування в залежності від значення рН навколишнього середовища і, таким чином, визначають заряд білка. Тому вони відповідають за вплив електричного поля на білки. В ізоелектричній точці (pI) позитивні та негативні заряди на білку виключають один одного. PI відповідає значенню pH, при якому білок має чистий заряд нуля. Електричне поле більше не діє як сила на нейтральний до заряду білок, і білок осідає. Зміни розташування в сусідніх діапазонах рН, спричинені дифузією, призводять до оновленої електричної зарядки білка. Однак повторно ефективне електричне поле негайно повертає білок до його ізоелектричної точки. Доступні дві різні технології IEF.

Іммобілізовані градієнти рН (IPG): Гелева смужка складається з поліакриламідної матриці. Один кінець гелевої смужки містить похідні акриламіду з кислими бічними ланцюгами в матриці та ті, що мають лужні функціональні групи, з іншого боку. Сополімеризація нейтрального акриламіду з доданими в градієнт кислотними та основними похідними створює незмінний, нерухомий градієнт рН.
Градієнти рН на основі амфолітів-носіїв: Амфоліти-носії - це синтетичні амінокислоти і вільно пересуваються в гелевій смужці або довгому циліндричному гелі (зазвичай у пробірці). Коли застосовується електричне поле, вони утворюють градієнт рН, який, однак, з часом нестабільний. Зі збільшенням часу носії заряду, що визначають градієнт, мігрують до кінців гелю і рано чи пізно деформують його хід.

Врівноваження

У так званому рівновазі, яке слідує за поділом після pI, гель з білками спочатку відновлюється (наприклад, меркаптоетанолом або дитиотрейтолом). Це служить для видалення дисульфідних містків. Щоб запобігти повторному окисленню отриманих груп -SH HS до дисульфідних (-S-S-) груп, на наступному кроці групи HS z. Б. алкільований йодоацетамідом. Нарешті, білки завантажуються додецилсульфатом натрію (SDS). SDS є негативно зарядженим миючим засобом. На кожні 3 амінокислоти приблизно одна молекула SDS зв'язується з молекулою білка через її аліфатичний кінець за допомогою гідрофобної взаємодії. Негативно зарядженою стороною він відштовхується від заряджених кінців поблизу пов'язаних молекул SDS. Це призводить до повного розгортання (лінеаризації) молекул білка. Чим більше молекула білка, тим довші отримані ланцюги завантажуються SDS. Оскільки, залежно від довжини білка, зв’язується велика кількість негативно заряджених молекул SDS, внутрішнім зарядом для більшості білків згодом можна знехтувати.

Другий вимір (SDS-PAGE)

Гелеву смужку з білками, розділеними та врівноваженими відповідно до значення рН, розміщують на краю квадратного або прямокутного поліакриламідного гелю, що також містить SDS, і білки тепер відокремлюють відповідно до їх розміру, перпендикулярно першому виміру в другому електрофорезі. Коли застосовується електричне поле (анод навпроти гелевої смужки IEF), розгорнуті білки, оточені SDS, мігрують із надлишком негативних зарядів через гель, що забезпечує більшу чи меншу стійкість білків відповідно до їх молекулярних розмірів. Маленькі молекули мігрують відносно безперешкодно і швидко досягають краю гелю, зверненого гелем IEF, тоді як великі молекули гелем постійно сповільнюються, коли вони мігрують і навряд чи роблять прогрес. Поділ у другому вимірі припиняється, коли дрібні білки потрапляють на край гелю, звернений убік від гелю IEF. Це робить помітним барвник, який проходить разом з ним, наприклад, бромофенольний синій. Для того, щоб модель білка залишалася присутньою після поділу, її потрібно зафіксувати на завершальному етапі. Для цього використовують метанол та оцтову кислоту. Вони денатурують відокремлені білки і приєднують їх до матриці гелю. Це запобігає дифузії, і 2D-картина стабільна з часом.