Експериментальний підхід до вивчення сигналізації лептину в каротидних тілах та його впливу на контроль
Резюме
Наше дослідження фокусується на впливах сигналізації лептину в каротидному тілі (CB) на реакцію гіпоксичної вентиляції (HVR). Ми провели експерименти "втрати функції" для вимірювання ефекту лептину на HVR після денервації CB та експерименти "посилення функції" для вимірювання HVR після надмірної експресії рецептора лептину в CB.
Анотація
Гормон, виготовлений з адипоцитами, лептин, є потужним стимулятором дихання, який може зіграти важливу роль у захисті дихальної функції при ожирінні. Каротидні тіла (CB), ключовий орган периферичної гіпоксичної чутливості, виражають тривалу функціональну ізоформу рецептора лептину (LepR b), але роль сигналу лептину в контролі дихання до кінця не вивчена. Ми досліджували гіпоксичну вентиляційну реакцію (HVR) (1) у мишей C57BL/6J до та після введення базового лептину та після денервації CB; (2) у мишей з дефіцитом LepR b, з ожирінням db/db мишей на початку та після надмірної експресії LepR b у CB. У мишей C57BL/6J підвищений лептин HVR та вплив лептину на HVR були скасовані шляхом денервації CB. У db/db мишей експресія lepR b у CB подовжувала HVR. Отже, ми робимо висновок, що лептин у CB працює для посилення реакції на гіпоксію.
Вступ
Адипоцит виробляє гормон лептин, який діє в гіпоталамусі, щоб придушити споживання їжі та збільшити швидкість метаболізму. Дослідження в нашій лабораторії 1, 2 та іншими дослідниками 3, 4 показали, що лептин посилює гіперкапнічну дихальну реакцію (HVR), гіповентиляція ожиріння в лептині запобігає дефіциту ожиріння. Однак більшість людей із ожирінням мають високий рівень лептину в плазмі крові та виявляють стійкість до метаболічного та респіраторного впливу гормонів 5, 6, 7, 8. Стійкість до лептину є багатофакторною, але обмежена проникність гематоенцефалічного бар'єру (ВВВ) до лептину відіграє важливу роль. Ми припускаємо, що нижче рівня ВВВ лептин діє у ключовому органі периферичної гіпоксичної чутливості, каротидному тілі (CB), для захисту дихання у людей із ожирінням. CB експресують тривалу функціональну ізоформу рецептора лептину LepR b, але роль CB у більш дихаючих ефектах лептину не з'ясована належним чином 9, 10 .
Метою нашого методу було дослідити вплив сигналізації лептину в CB на HVR. Наше обґрунтування полягало в тому, щоб (а) здійснити спекулятивні винятки з експериментів з функціями на мишах з неушкодженими каротидними тілами та денервованими каротидними тілами з подальшим вимірюванням HVR; b) Посилення функціональних експериментів на db/db мишах без LepR b, в яких ми вимірювали HVR на початку та після експресії LepR b виключно в CB. Перевага наших методів полягала в тому, що ми проводили всі свої експерименти на нестримних, неестетизованих мишах під час сну та неспання. Попередні дослідники або проводили свої експерименти під наркозом 9, або не вимірювали ефекти лептину під час сну 10. Крім того, наше дослідження першим застосувало унікальний підхід посилення функції із селективним вираженням LepR-b у CB, описаному вище.
У широкому контексті наш підхід можна узагальнити до інших рецепторів, виражених у CB, та їх ролі в гіпоксичній чутливості. Дослідники можуть вводити ліганд рецептору, що нас цікавить, і вимірювати HVR при настанні та після денервації CB. Як додатковий підхід, рецептор, що цікавить, може бути надмірно вираженим у вимірах CB, а виміри HVR можуть бути виконані до і після надмірного вираження за допомогою нашої технології, описаної в цьому рукописі.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Протокол
Усі експериментальні протоколи були схвалені Інституційним комітетом з догляду та використання тварин (MO18M211).
ПРИМІТКА: Для вивчення впливу лептину на дихання ми вводили лептин підшкірно нежирним мишам C57BL/6J через осмотичний насос, щоб збільшити рівень лептину в циркуляції до тих, що спостерігаються у мишей із зайвою вагою.
- Підготовка осмотичного насоса
- Зважте порожній насос, щоб перевірити власну вагу завантаженого розчину.
- Додайте лептин (5 мг/мл) до осмотичного насоса (1 л/год протягом 3 днів). Наповніть насос невеликим шприцом (1 мл). Після наповнення закрийте насос за допомогою накладеної встик 27-колісної заливної трубки.
ПРИМІТКА: У шприці та приєднаній трубці не повинно бути бульбашок повітря. - Після наповнення знову зважте насос, щоб перевірити власну вагу розчину.
- Введіть лептиновий насос підшкірно в міжлопаткову область.
ПРИМІТКА: Якщо ви хочете негайно розпочати інфузію, інкубуйте попередньо заповнений насос при температурі 37 ° C при 37 ° C принаймні від 4 до 6 годин (бажано протягом ночі).
2. Гіпоксична вентиляційна реакція (HVR)
3. Денервація каротидного тіла або розсічення нервового сонного синуса (CSND)
ПРИМІТКА: Ми проводили комбіновану хірургічну та хімічну денервацію з інтервалом в один тиждень, оскільки хірургічна денервація сама по собі не скасовує гіпоксичний хеморефлекс.
4. Експресія LepR b в CB з аденовірусним вектором (Ad-LepR b) проти контролю (Ad-LacZ)
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Репрезентативні результати
Безперервна інфузія лептину суттєво збільшувала HVR у нежирних мишей C57BL/6J з 0,23 до 0,31 мл/хв/г/FiO2 (P Рисунок 2) 11. CSND скасував підвищення HVR, спричинене лептином (рис.2), в той час як ніяких пом’якшувальних ефектів CSND на HVR не спостерігалося в групі фіктивних операцій після інфузії лептину.
Експресія LepR b у CB мишей, що страждають ожирінням db/db, спричинених LepR b, індукує значне збільшення HVR з 0,05 до 0,06 мл/хв/г/SpO2 (рис.3).). HVR не змінювався у тварин, трансфікованих у CB з контролем Ad-LacZ.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Обговорення
Основним завданням нашого дослідження було вивчення більш повітропроникних ефектів сигналізації лептину в ЦБ. Було розроблено кілька протоколів для оцінки ролі лептину механістичним способом. Спочатку був проаналізований питомий внесок ЦБ в МГП шляхом ретельної кількісної оцінки МГП протягом перших 2 хв гіпоксичного впливу. По-друге, відповідність CB для опосередкованого лептином регуляції дихального контролю досліджували за допомогою двох додаткових підходів. У худих мишей дикого типу з низьким рівнем лептину HVR вимірювали на початку та після безперервної інфузії лептину; експеримент повторили після денервації CB. У мишей з дефіцитом LepR b/db мишей HVR вимірювали в CB на початку та після експресії LepR b.
CSND у мишей є технічно вимогливим через невеликий розмір тварин та їх CB. Ми розробили стабільно успішний підхід із рівнем виживання майже 100% у суворій відповідності з нашим протоколом. Контрольовані умови в нашому протоколі включають термонейтральне середовище, ретельно контрольовану анестезію та стандартні стерильні мікрохірургічні методики з візуалізацією язиково-глоткового нерва як пильне післяопераційне лікування з контролем болю. Наш досвід показує, що хірургічна денервація сама по собі не скасовує гіпоксичний хеморефлекс. Другий крок, хімічна денервація, супроводжується ретельним післяопераційним лікуванням для поліпшення виживання.
Наша найбільш інноваційна методика - це селективна надмірна експресія генів у зоні CB. Цей підхід ще не реалізований, оскільки КБ мають лише невеликі розміри і не виражаються конкретні фактори, що дають можливість виразити ген, що цікавить певний тип клітини. Насправді клітини CB типу I дуже схожі на симпатичні нейрони або клітини мозкової речовини надниркових залоз, тоді як клітини типу II подібні до астроцитів 20, 21. Ми скористалися мишами db/db, у яких відсутній ген LepR b, нашою здатністю застосовувати аденовірусну суспензію майже виключно до зони CB та властивостями матриці Matrigel, яка швидко застигає при 37 ° C. Наш новий підхід може бути використаний у майбутньому для дослідження ролі будь-якого гена, який експресує специфічні для тирозину гідроксилази (клітини типу I) або GFAP-специфічні (клітини типу II) у CB з мишами всього тіла стає.
Наші протоколи мають кілька обмежень. Спочатку ми використали 3% СО2 для визначення МГП, і залишається питання, чи насправді частку МГП можна віднести до гіперкапнічної реакції. Щоб усунути це обмеження, дослідники можуть одночасно вимірювати реакцію на 3% компенсацію СО2 у гіпероксичному газі, що вимкне CB. По-друге, HVR неможливо повністю усунути CSND 22. Це явище можна віднести до нейропластичності, яка особливо виражена у мишей. Отже, важливо вивчити HVR якомога швидше після CSND і завжди використовувати фіктивний контроль хірургії. По-третє, у нашому підході до експресії генів CB не було типів клітин та специфічності органів. Молекулярні методи з подальшим використанням більш вибіркових промоторів можуть допомогти протидіяти цьому обмеженню.
На закінчення, незважаючи на описані вище обмеження, наші протоколи можуть досліджувати роль певних генів CB у фізіологічній реакції на гіпоксію.
Потрібна передплата. Будь ласка, порекомендуйте JoVE своєму бібліотекареві.
Розкриття інформації
Автори не мають суперечливих інтересів чи відкриттів.