Ентодермальна, печінкова диференціація

1 Потенціал ендодермальної, печінкової диференціації дорослих та ембріональних стовбурових клітин in vitro та in vivo, представлений випускницею біотехнології Аннікою Вульф-Гольденберг з Берліна з факультету III технологічних наук Технічного університету в Берліні для здобуття вченого ступеня доктора технічних наук - д-ра. Інж. - Затверджена дисертація Докторський комітет: Голова: проф. Д.і.н. Лікар. У. Шталь Репортер: проф. Д-р Р. Лостер Репортер: доктор хабіл. Доповідач І. Фіхтнера: проф. Дж. Куррек День наукової дискусії: 30 березня 2010 р. Берлін 2010 р. D 83

печінкова

2 Розумієш, Момо, сказав підмітальний пристрій Беппо, це приблизно так: Іноді перед тобою дуже довга дорога. Ви думаєте, що це так страшенно довго; ти ніколи не можеш цього зробити, ти думаєш. І тоді ти починаєш поспішати. І поспішає дедалі більше. Кожного разу, піднявши очі, ви бачите, що попереду не менше. І ти стараєшся сильніше, тобі стає страшно, і в підсумку ти зовсім задихаєшся і більше не можеш. А дорога ще попереду у вас. Ви не можете зробити це так. Ніколи не слід думати про всю вулицю одразу, розумієш? Потрібно лише подумати про наступний крок, потім наступний вдих, наступний удар мітлою. І завжди лише до наступного. Тоді це одне задоволення; це важливо, тоді ти добре робиш свою роботу. І саме так повинно бути. Раптом ти розумієш, що пройшов всю дорогу крок за кроком. Ви навіть не помітили, як, і ви не задихаєтесь. Це важливо. Майкл Енде, з «Момо» Для батьків, бо ти навчив мене ходити вулицею мужньо та впевнено.

5 С у м е н г е с у н т 5 клітин. Однак чіткої диференціації на функціональний гепатоцит не досягнуто. Вибрані умови індукції диференціації in vitro кондиціонованих середовищ та кокультури дозволили клітинам CD34 + дещо диференціюватись у клітини печінкової ендодерми. Ендодермальна печінкова диференціація може індукуватися в людських ембріональних стовбурових клітинах лінії SA002 системами in vitro. Вибрані умови in vitro показують, що прямий контакт у спільній культурі може викликати диференціювання ефективніше, ніж кондиціоновані середовища в стовбурових клітинах. Однак існує потреба вдосконалити існуючі протоколи диференціації. Розроблені моделі in vivo складають основу для тестування та порівняння in vitro диференційованих клітин.

11 Вступ 11 1 Вступ 1.1 Огляд різних типів стовбурових клітин та їх властивостей Стовбурові клітини визначаються на основі двох критеріїв (Verfaillie et al., 2002): здатності до самообновлення та потенціалу розвитку в різні типи клітин. Залежно від онтогенетичного віку розрізняють два типи стовбурових клітин: ембріональні та дорослі стовбурові клітини з різним потенціалом диференціації тоті-, плюрі-, мульти- або уніпотентності (див. Рисунок 1). Рисунок 1 Типи стовбурових клітин з їхнім диференціаційним потенціалом Одна тотипотентна стовбурова клітина має необмежений потенціал диференціації та здатність розвиватися в цілісний організм. Плюрипотентні стовбурові клітини

56 Рекціони 56 виявляли апоптоз. Деякі гени беруть участь у проліферації клітин, зв’язуванні цитокінів, реплікації ДНК, хемотаксисі та кровотворенні (Додаток). Таблиця 10 Вибрані профілі регульованої експресії генів клітин CD34 + після 10-денного посіву в середовищі StemSpan, в кондиційному середовищі Герарді та в кондиціонованому середовищі Саутін порівняно з необробленими стовбуровими клітинами. Термін Ген немає StemSpan-Medium Condi. Gherardi-Medium Kondi. Саутин середній% p ген ні% p ген ні% p GO:

клітина% 5,54E% 1,41E-06 проліферація GO:

мононуклеарна %% проліферація клітин GO:

мітоз% 1,19E% 3,54E% 8,55E-22 GO:

Реплікація ДНК %% 5,24E + 10 GO:

клітинний цикл% 2,16E% 3,23E% 7,13E-16 GO:

апоптоз% 5,56E% 4,75E% GO:

диференціація клітин %% GO:

механорецепт або диференціація %% GO:

лізосома% 6,67E% 1,49E% 3,57E + 02 GO:

57 Результати 57 Стовбурові клітини, культивовані в кондиціонованому саутиновому середовищі, експресували таку ж кількість генів, як стовбурові клітини в кондиційному середовищі Герарді, 604 генетично регульовані гени та 1126 гени, регульовані вниз, порівняно з некультивованими стовбуровими клітинами. Здебільшого гени, що належать до клітинного циклу, зовнішнього подразника, гормональної стимуляції та біосинтезу стероїдів, були регульованими (Додаток). Також спостерігалося накопичення генів, пов’язаних з мікротрубочково-цитоскелетною організацією та біогенезом, таких як MID1IP1 та KIF11. Гени з груп розвитку епідермісу, вогнищевої адгезії, згортання крові та кровообігу також виражалися в підвищеній формі. Загалом у цьому середовищі було виявлено більшість кластерів з високими профілями транскрипції клітинного циклу, реплікації ДНК та хромосом, а також найменшу кількість для апоптозу. Сигнальні шляхи, що регулюються вниз, являли собою адренас-з'єднання, молекули клітинної адгезії та сигнальні шляхи рецепторів В-клітин. Крім того, гени, що належать до ядра, зв'язування фактора транскрипції, ангіогенезу, зв'язування MHC класу I та продукування хемокінів були виражені менше, ніж у не культивованих стовбурових клітинах. Експресія виділених генів функціональної групи GO:

58 Результати 58 Таблиця 11 Зміна експресії генів виділених генів з бази даних GOTERM_BP_ALL та функціональної групи: GO:

61 Результати 61 Ранні ендодермальні маркери, такі як SOX17, експресуються після короткого періоду культивування, а пізні маркери, такі як альбумін, експресуються на низькому рівні в стовбурових клітинах після більш тривалого періоду культивування. Таблиця 12 Спільне культивування CD34 + стовбурових клітин з клітинами AML12. МРНА виділяли у певний час, а вибрані гени визначали за допомогою напівкількісної RT-PCR (TaqMan). Було показано, що спільна культура з клітинами AML12 знижує регуляцію клітин CD34 +, знижуючи експресію генів CD34, і ендодермальні маркери трохи піднімаються. Gen 0d 7d 21d CD SOX FOXA AFP CEBPA HNF4A -/+ -/+ n.a. ALB -/+ -/+ + KRT n.a. KRT n.b. GATA4 - - н.а. CDH n.b. GJB1 -/+ ++ n.a. GJA n.b. KRT n.b. Легенда: qrt-pcr: ++++ CT 0,0-4,0; +++ КТ 4.1-8.0; ++ КТ 8,1-12,0; + 12,1-16,0;

Якщо результати зростали на 64, тварин опромінювали 1,6 Гр із джерела 137 цезію-γ. Нульові миші NOD/SCID/IL2Rγ також переносили цю дозу опромінення. Тимусні залози імунодефіцитних мишей NOD/SCID були дуже малі порівняно з імунокомпетентною мишкою NMRI як контролем. Вони також не продемонстрували чіткого розділення кістково-мозкової та кортикальної зон і були гіпопластичними (рисунок 12). У тимусовій тканині у досліджуваних імунодефіцитних тварин периваскулярно було видно лише дуже мало лімфоцитів. Тимус нульових мишей NOD/SCID/IL2Rγ нагадував тимус мишей NOD/SCID. a b Рисунок 12 Гістопатологічне дослідження тимусу імунокомпетентної NMRI миші (a) та імунодефіцитної NOD/SCID миші (b).

66 результатів 66 a% HLA-I позитивні клітини людини (нормалізовані), 7 3,2 3,1 2,2 1,7 1, хв 30 b 80 A 1 A 2 A 3 A 4 60 A1,1 A Середнє AB 1 B 2 20 B 3 B 4 Середнє B 0% клітин людини c 20% клітин людини Кістковий мозок PBS SCF днів через iv застосування Селезінка PBS SCF днів після iv застосування Рисунок 13 Залежний від часу кліренс крові системно застосованих клітин CD34 + у мишей NOD/SCID ( а). 4x10 5 CD34 + клітин вводили в/в. пересаджували опроміненим мишам. Неочищені (суцільна, синя лінія) або попередньо оброблені SCF клітини (штрихові, червона лінія) аналізували FACS в мишачому кровообігу через 1, 5 і 20 хвилин після нанесення. Було визначено кількість людських HLA-I позитивних клітин із проковтнутих клітин. Результати є результатом загалом трьох експериментів. Довготривале приживлення необроблених та попередньо оброблених SCF стовбурових клітин у мишей NOD/SCID (b, c). Неліковані та попередньо оброблені SCF клітини вводили в/в. застосовували, а кістковий мозок (b) та селезінку (c) аналізували за допомогою проточної цитометрії із специфічним для людини антитілом HLA-I. Значення є середніми ± SEM 6-9 мишей на групу.

88 A b c 2µm d e s etiotions 88 a b c 2µm d e Рисунок 27 Вираження маркерів плюрипотентності на недиференційованих стовбурових клітинах SA002. Імуноцитометричне визначення SSEA-4 (a), TRA-1-60 FITC (b) та Oct-4 (d). Недиференційовані клітини SA002 на ультраструктурному рівні (c). Клітини характеризуються великим співвідношенням ядро-плазма (ядро темне). Каріограма стовбурових клітин SA002 р41; Пляма Гімзи (e). Описаний каріотип 47, XX + 13 міг бути виявлений для клітин. Для перевірки стабільного каріотипу під час тривалого культивування проводили аналіз каріотипу на лінії ембріональних стовбурових клітин SA002. Аналіз і визначення каріограми проводила компанія IMMD Berlin. Лінію стовбурових клітин культивували з пасажем 18 і механічно перетворювали 23 рази до першого аналізу. SA002-