Фагоцити, що переносяться кров’ю, інтерналізують мікроагрегати уратів і запобігають нетозу
Теми
Анотація
На відміну від синовіальних рідин або сечі пацієнтів з гіперурикемією, наявність nsMSU ніколи не описувалось у крові. Наявність nsMSU у крові може мати несприятливі наслідки для господаря, оскільки внутрішньосудинне утворення nsMSU та подальша індукція NETosis включає ризик атеросклерозу, що загрожує життю, підвищеної проникності судин та тромбозу. 11, 12, 13 .
У цьому дослідженні ми досліджували кристалізацію сечової кислоти в гіперурикемічній крові. Ми з'ясували новий механізм, за допомогою якого кров'яні фагоцити очищають невеликі UMA, спочатку утворені в гіперурикемічній крові, перш ніж вони зможуть фактично перерости в nsMSU, індукуючи NET. Якщо цей механізм виходить з ладу, nsMSU та NET утворюють тофусоподібні агрегати, стійкі до DNase I з високим обструктивним потенціалом.
Результати
Сечова кислота кристалізується ex vivo в гіперурикемічній сироватці та цільній крові
( в ) Невеликі круглі мікроагрегати уратів (UMA), що розвинулися після інкубації in vitro гіперурикемічної сироватки. Показані репрезентативні зображення. ( ) Кристалізація сечової кислоти відбувалась переважно при більш холодних температурах і насичувалася через 6 годин гіперуремічної інкубації сироватки. Кількість UMA оцінювали за допомогою мікроскопії з поляризованим світлом, відзначали кількість UMA на поле зору (FOV; збільшення у 200 разів). ( проти ) Інкубація гіперурикемічної цільної крові протягом 6 годин ex vivo показала внутрішньоклітинну присутність UMA у кров’яних фагоцитах (білі стрілки) у мазках крові. Червоні стрілки представляють еритроцити. Представлені репрезентативні зображення двох пацієнтів з гіперурикемічною подагрою. Шкала шкали: 20 мкм (вставки: 5 мкм).
Повнорозмірне зображення
Фагоцити, що переносяться кров'ю, швидко інтерналізують АМУ
Фетуїни - це білки-носії, які зв'язують і розчиняють насіннєві кристали фосфату кальцію 18. Тому ми перевірили, чи сприяють фетуїни також фагоцитозу АМУ. Ми спостерігали збільшення фагоцитозу АМУ у нейтрофілах на 40%, коли 10% активної аутологічної сироватки додавали 1 мг/мл фетуїну або його дезіалізованої форми азіалофетуїну (рис. 2д). Цікаво, що використання аутологічної 10% -ної інактивованої теплом сироватки, ні азіалофетуїн, ні фетуїн не сприяли фагоцитозу АМУ нейтрофілами. У сукупності наші дані виявляють механізм співпраці між фетуїнами та білками комплементу для полегшення фагоцитозу АМУ нейтрофілами.
Макрофаги розпізнають і усувають фагоцити, завантажені UMA
( в ) За відсутності фагоцитів, nsMSU розвивається в гіперуремічній сироватці. ( ) Попадання нейтрофілами величезної кількості UMA та nsMSU (ліві панелі) спричинило помірну та важку гіперцитрулінізацію гістону H3 у культивованих гранулоцитах (права панель, білі стрілки). ( проти ) Цитрулінізація гістону H3 (ліва панель) та вивільнення ДНК (середня панель) відбувались переважно у відповідь на nsMSU, тоді як вироблення АФК було значно вищим у відповідь як на UMA, так і на nsMSU (права панель). Стрижні шкали: 30 мкм (вставки: 10 мкм). *** стор
(1) UMA, що вводиться внутрішньовенно (1 мг), елімінується у мишей, розташованих у синусоїдах печінки або в крайовій зоні селезінки (жовті стрілки вказують на UMA), тоді як інші органи не містять (серце, нирки) ) дуже мало (легені). ) UMA. ( ) Кількість UMA на орган визначали кількісно, аналізуючи принаймні чотири різні поля зору (FOV) із збільшенням у 200 разів на наявність UMA. Шкала шкали: 100 мкм. ** р # р
На відміну від інших досліджень 36, 37, ми не спостерігали жодної цитотоксичної дії кристалічно-індукованих NET на ендотеліальні клітини. Натомість наявність лейкоцитів запобігало прозапальну дію AMU та nsMSU на ендотелій. Цей процес включав захоплення кристалів великими агрегованими TNE. Таким чином, хоча, як правило, вважають, що cMSU діють протизапально шляхом лігування платоподібних рецепторів та подальшої активації сигналів NF KB 38, 39, 40, протизапальний ефект cMSU зменшується, коли вони потрапляють у NET. Слід зазначити, що ми виявили, що DNase I лише розбирає та розчиняє агреговані NET, що містять UMA, тоді як ті, що складаються з nsMSU, досить стійкі до активності DNase I.
Загалом, ми пропонуємо модель, в якій білки комплементу та фетуїни сприяють кооперативному очищенню фагоцитів, що переносяться кров’ю, та резидентних макрофагів АМУ, які спонтанно утворюються в гіперемумічній крові (рис. 8). Актуальність цього механізму кліренсу відображається у здатності nsMSU індукувати NETosis, що може мати несприятливі наслідки, якщо це відбувається в судинній системі. У здорових людей з гіперурикемією АМУ вивільнятиметься з кровообігу у статусі начемені. Це запобігає зростанню нових кристалів та утворенню потенційно шкідливих nsMSU. Оскільки кліренс АМУ суттєво погіршується за відсутності факторів комплементу або фетуїну, пацієнти з хронічною нирковою недостатністю та/або низьким рівнем цих білків плазми крові (41, 42, 43, 44, 45) можуть потенційно схильні до розвитку НЕТ. - індуковане запалення судин.
UMA - це перші кристали, що спостерігаються в гіперурикемічній крові після декількох годин інкубації. Вони негайно поглинаються фагоцитами, що переносяться кров’ю, перш ніж стати nsMSU. Фагоцитозу сприяє опсонізація комплементом та фетуїном. Потім фагоцити, завантажені UMA, виводяться з кровообігу макрофагами, що мешкають у крайовій зоні селезінки, або синусоїдами печінки. Якщо його неправильно видалити, UMA стає небезпечним мережевим nsMSU. Це несе ризик утворення внутрішньосудинних тофів і тромбів та закупорки судини.
Повнорозмірне зображення
Матеріали і методи
Матеріал пацієнта
Сироватку та гепаринізовану цільну кров відбирали у восьми пацієнтів з гіперурикемією та контролем нормурикемії. Концентрацію сечової кислоти визначали звичайними лабораторними методами. Усі проаналізовані зразки пацієнтів були анонімно передані нашому науковому факультету і перевищили концентрацію сечової кислоти в 12 мг/дл. Деякі зразки були гіпернасичені сечовою кислотою до 21 мг/дл, значно перевищуючи межу розчинності близько 7 мг/дл. Сироватку та цільну кров інкубували при 4 ° C та 37 ° C та аналізували на формування кристалічних структур за допомогою відео мікроскопії поляризованого світла. Здорові донори служили контролем. Для деяких експериментів сироватку відбирали у пацієнтів із дефіцитом комплементу (C4A, C4B, C4, C2 або C1q). Інформована згода на здачу крові була отримана від усіх суб’єктів для всіх методів. Усі експерименти на людському матеріалі виконувались відповідно до інституційних вказівок і були схвалені комітетом з етики університетської лікарні Ерлангена.
Тварини
Мишей Balb/c виховували у Львівському національному медичному університеті імені Данила Галицького, Львів, Україна, з січня по серпень 2014 року та дотримувались їх на стандартній дієті з необмеженою кількістю питної води. Всі дослідження на тваринах проводились відповідно до керівних принципів, встановлених Законом Міністерства охорони здоров’я України № 281 від 01.11.2011 р. Щодо догляду та використання лабораторних тварин, та затвердженим Радою з питань етики Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького. Університет, протокол 1/6 від 24 червня 2013 р.
Кліренція UMA in vivo
Для експериментів in vivo 1 мг UMA або nsMSU вводили внутрішньовенно в 250 мкл PBS мишам Balb/c. Кріосекції серця, нирок, легенів, селезінки та печінки готували без будь-якої фіксації через 24 години після ін’єкції та аналізували за допомогою мікроскопії з поляризованим світлом. Оскільки тварини загинули відразу після ін’єкції nsMSU, ми використовували UMA лише для остаточного аналізу з етичних міркувань.
Виділення нейтрофілів
Нейтрофіли виділяли з гепаринізованої крові (20 Од/мл) центрифугуванням з градієнтом щільності з використанням Lymphoprep (Stemcell Technologies). Коротко кажучи, цільну кров розбавляли 1: 1 у PBS до обсягу 30 мл і повільно наносили на 15 мл Лімфопрепу. Потім кров центрифугували при 800g протягом 20 хвилин, а нейтрофіли збирали з фракції високої щільності. Залишкові еритроцити видаляли повторним гіпотонічним лізисом. Життєздатні нейтрофіли підраховували в камері підрахунку клітин Нойбауера.
Тести на фагоцитоз
Для експериментів фагоцитозу ex vivo свіжу цілу антикоагульовану кров інкубували при 37 ° C з UMA. Потім еритроцити видаляли шляхом гіпотонічного лізису. Лейкоцити фарбували за допомогою анти-CD16 (кат. № B-E16-FITC, Abcam) та анти-CD14 (кат. № 61D3-PE, eBioscience) та аналізували за допомогою проточної цитометрії. Для експериментів фагоцитозу in vitro очищені нейтрофіли (2 × 10 6 клітин/мл) стимулювали 50 пг UMA на клітину в присутності 10% аутологічної сироватки. Сироватка була попередньо оброблена, як вказано. Фагоцитарні індекси (PhIx) для UMA розраховували шляхом множення відсотка клітин із збільшеним бічним розсіюванням на середнє значення бічного розсіювання. Де вказано, фагоцитоз підтверджували шляхом впливу нейтрофілів на UMA у присутності 100 нМ pHrodo Red SE (Life Technologies) та подальшого аналізу флуоресценції, що переноситься клітинами, за допомогою проточної цитометрії. Проточну цитометрію та аналіз даних проводили із застосуванням цитофлуорометра Галліоса та програмного забезпечення Kaluza відповідно (Beckman Coulter).
Спільні культури нейтрофілів та макрофагів
Аналізи нетозу
Очищені нейтрофіли стимулювали 50 пг кристалів на клітину (або UMA, або голкоподібні nsMSU) протягом 4 годин, або в статичних умовах, або в умовах потоку. Для останнього клітини обробляли кристалами на качалці або в насосній системі, даючи ламінарну швидкість потоку 20 мл/хв (Ібіді). NETosis оцінювали шляхом кількісного визначення вивільнення ДНК за допомогою флуорометрії або імунофлуоресцентної мікроскопії. Для обох методів позаклітинна ДНК фарбували 100 нМ Sytox Orange. Активність NET-асоційованої нейтрофільної еластази (NE) та мієлопероксидази (MPO) визначали за допомогою колориметрії, використовуючи 100 мкМ N-метоксисукциніл-Ала-Ала-Про-Вал 4-нітроаніліду (Sigma-Aldrich) або 1 мМ 3 ′, 5, 5′-тетра-метилбензидин (eBioscience) як субстрати для NE та MPO відповідно. Для вимірювання АФК нейтрофіли стимулювали у присутності 40 мкМ 2 ′, 7′-дихлорфлуоресцину діацетату (Sigma-Aldrich).
Культура клітин ендотелію та ПЛР у режимі реального часу
Виробництво nsMSU та UMA
Розчин 10 мМ сечової кислоти та 154 мМ NaCl (рН 7,2) перемішували протягом 3 днів, утворюючи nsMSU. Отримані кристали промивали етанолом і стерилізували при 180 ° C протягом 2 годин перед зберіганням у PBS. Для експериментів з UMA ми широко подрібнювали nsMSU в стерильних умовах, використовуючи керамічні кульки Precellys (1,4 мм). Схожість за розмірами та формою між цими штучно виготовленими УМА та тими, що спостерігаються в гіперурикемічній крові, оцінювали за допомогою мікроскопії поляризованого світла.
статистичний аналіз
Результати представлені як середнє значення ± SEM принаймні трьох та до десяти незалежних експериментів. Значущість визначали або за допомогою t-тесту Стьюдента, або одностороннього ANOVA з подальшою корекцією Бонферроні за допомогою GraphPad Prism. Значення P ≤ 0,05 вважали статистично значущими.
Додаткова інформація
Як цитувати цю статтю: Pieterse, E. та співавт. Кровоносні фагоцити інтерналізують мікроагрегати уратів та запобігають внутрішньосудинному НЕТозу кристалами уратів. Наук. Респ. 6, 38229; doi: 10.1038/srep38229 (2016).
Примітка редактора: Springer Nature залишається нейтральним щодо юрисдикційних вимог в опублікованих картах та приналежності до інституцій.