Геноми
Юрген Маркл
12 Інститут молекулярної фізіології, Університет Йоганнеса Гутенберга, Майнц, Німеччина
Девід Садава
13 Науковий центр Кека, Клермонт, Каліфорнія, США
Девід М. Хілліс
14 Техаський університет в Остіні, Остін, Техас, США
Х. Крейг Хеллер
15 Стенфордський університет, Стенфорд, Каліфорнія, США
Саллі Д. Хакер
16 Університет штату Орегон, Корвалліс, Орегон, США
Андреас Хелд
Біргіт Ярош
7 Jarsoch Text, Аахен, Північний Рейн-Вестфалія Німеччина
Лотар Зайдлер
Моніка Нігаус-Остерлох
Єва Сікст
10 Мюнхен, Баварія, Німеччина
Матіас Дельбрюк
Дослідження захоплення: Проект геному собаки
Canis lupus familiis, домашня собака, була одомашнена людьми приблизно 15 000 років тому. Хоча існує багато різних сортів вовків, вони досить схожі, але це не так у випадку з «найкращим другом людини». Fédération Cynologique Internationale (FCI), найбільша у світі парасолькова організація для заводчиків собак, визнає понад 300 порід собак. Генетики припускають близько 100 справжніх порід собак, решта - різновиди. Не тільки породи собак виглядають зовсім по-різному, але вони також сильно відрізняються по зросту. Наприклад, середня чихуахуа важить лише 1,5 кг, а шотландський гончий - 70 кг. Жоден інший ссавець не виявляє такої великої фенотипової мінливості. Існують також сотні генетичних захворювань у собак, і багато з них мають аналогів у людей. Проект геном собак розпочався наприкінці 1990-х, щоб з’ясувати, які гени відповідають за генетичну мінливість та зв’язок між генами та захворюваннями.
Дослідження захоплення: Проект геному собаки
Canis lupus familiis, домашня собака, була приручена людьми приблизно 15 000 років тому. Хоча існує багато різних сортів вовків, вони досить схожі, але це не так у випадку з «найкращим другом людини». Fédération Cynologique Internationale (FCI), найбільша у світі парасолькова організація для заводчиків собак, визнає понад 300 порід собак. Генетики припускають близько 100 справжніх порід собак, решта - різновиди. Не тільки породи собак виглядають зовсім по-різному, але вони також сильно відрізняються по зросту. Наприклад, середній чихуахуа важить лише 1,5 кг, а шотландський гончий - 70 кг. Жоден інший ссавець не виявляє такої великої фенотипової мінливості. Існують також сотні генетичних захворювань у собак, і багато з них мають аналогів у людей. Проект геном собак розпочався наприкінці 90-х років, щоб з’ясувати, які гени відповідають за генетичну мінливість і як гени та хвороби пов’язані.
Першими двома собаками, які повністю генемували геном, були боксер і пудель. ДНК собачого геному містить 2,8 мільярда пар основ в 39 парах хромосом. Він містить 19 000 генів, що кодують білок, більшість з яких мають аналог у інших ссавців, включаючи людей. Використовуючи повну послідовність геномів, вони почали картографувати генетичні маркери - специфічні короткі послідовності ДНК - у певних положеннях геному, які відрізняються у окремих собак або у порід собак.
Генетичні маркери служать для локалізації (і, таким чином, ідентифікації) генів, які контролюють певні характеристики. Наприклад, Елейн Острандер та її дослідницька група вивчають португальських водяних собак, щоб виявити гени, які контролюють розмір тіла. Видалення клітин для виділення ДНК було відносно легким: ви провели ватним тампоном внутрішню поверхню щоки. Ген інсуліноподібного фактора росту 1 (IGF-1) виявився важливим при визначенні розміру тіла: великі породи мають алель, що кодує активний IGF-1, тоді як у малих - один. нести алель для менш активного IGF-1.
Як і слід було очікувати, деякі вчені заснували компанії для тестування собак на генетичні варіанти на основі ДНК і, таким чином, для підтвердження "чистоти породи" зацікавленим власникам собак. Подібним чином було проведено секвенування геному домашніх котів, диких котів та різних великих видів котів. Порівняння цих геномів тварин допомагає визначити еволюційну історію різних ліній ссавців, а також визначити гени, які відповідають за захворювання та форми ознак, як це відбувається у різних видів ссавців. Такі дослідження, звичайно, не обмежуються лише ссавцями, але є геномні проекти по всьому царству тварин, включаючи рослини, гриби, багато інших еукаріотів та численні прокаріоти.
Які знання ми отримали шляхом секвенування геномів тварин?
Ви знайдете відповіді на це питання в “Експерименті: Порівняльний аналіз генома тигра” в розділі 17.1 та в “Дослідженнях захоплення” в кінці цього розділу.
Тепер геноми можна секвенувати дуже швидко
В Секвенування геному визначається послідовність нуклеотидів усього геному живої істоти. У прокаріот, який має одну хромосому, послідовність генома є безперервною послідовністю пар основ (bp). У диплоїдних видів, що розмножуються статевим шляхом з кількома аутосомами та парою статевих хромосом (Розділ 10.1007/978-3-662-58172-8_12 # Sec22), термін "секвенуваний геном" зазвичай відноситься до послідовності всіх основ у гаплоїдному Набір аутосом і дві статеві хромосоми (у людини 22 + 2, у собак 38 + 2).
Коротко
Геноми секвенуються у вигляді коротких фрагментів, які накладаються один на одного за допомогою перекриттів.
У функціональній геноміці інформація про послідовність використовується для визначення функцій різних частин геному.
У порівняльній геноміці порівнюються послідовності геномів різних організмів.
З розвитком технології секвенування ДНК стався вибух генетичної інформації, яку вчені можуть використовувати різними способами.
Можна порівняти геноми різних видів, щоб побачити, як вони відрізняються на рівні ДНК. Потім цю інформацію можна використовувати для розуміння еволюційних взаємозв’язків.
Можна порівняти послідовності особин у межах виду, щоб виявити мутації, що викликають певні фенотипи.
Інформацію про послідовності можна використовувати для ідентифікації генів певних типів ознак, таких як гени, пов’язані із захворюваннями.
Можна знайти послідовність ДНК генів, що кодують білок, і з цього можна вивести амінокислотну послідовність відповідних білків, якщо це все ще невідомо.
Базова послідовність короткого фрагмента ДНК може бути визначена швидко
Можливість послідовності всього геному складного організму навіть не розглядалася до 1986 року. Однак лауреат Нобелівської премії Ренато Дульбекко та інші вчені на той час пропонували мобілізувати наукове співтовариство у всьому світі для вирішення питання послідовності всього геному людини. Однією з причин було те, що людей, які пережили атомні бомбардування в Японії під час Другої світової війни та зазнали радіаційного опромінення, слід обстежити на предмет пошкодження ДНК. Але для того, щоб можна було визначити зміни в геномі людини, спочатку потрібно було знати його послідовність.
Тож це фінансувалося за державні гроші Проект геному людини розпочате, величезне підприємство, яке було успішно завершено в 2003 році - значно раніше, ніж очікувалося. Ці зусилля підтримувались та доповнювались приватними групами. Проект отримав користь від розробки багатьох нових та новаторських методів, які вперше були застосовані до секвенування менших геномів - від прокаріотів та просто побудованих еукаріотів, таких як модельні організми, з якими ви вже стикалися в попередніх розділах цієї книги. Багато з цих методів широко використовуються сьогодні, включаючи абсолютно нові методи, спеціально для секвенування геному. Методологічні розробки в цьому секторі тривають. Ці методи доповнюються новими методами вивчення фенотипового різноманіття білків та продуктів метаболізму в клітині. Основною вимогою був і є кардинальний подальший розвиток апаратного та програмного забезпечення комп’ютера, щоб мати можливість справлятися з величезними обсягами даних, що виникають.
У багатьох прокаріотів є одна хромосома, тоді як у еукаріотів багато хромосом. Через різний розмір хромосоми можна легко відокремити одна від одної. Здається, найбільш простим методом є початок секвенування хромосоми з одного кінця і просто секвенування всієї молекули ДНК, нуклеотид нуклеотидом. Завдання дещо спрощується тим фактом, що лише одна з двох ниток повинна бути послідовно розподілена, оскільки інша доповнює. Подивіться на послідовність
тоді інша нитка повинна виглядати так:
Однак навіть за сучасних методів секвенування молекули ДНК довжиною мільйонів пар основ від одного кінця до іншого не є ані можливим, ані необхідним. За допомогою цієї стратегії можна послідовно відстежити кілька тисяч пар основ. Для того, щоб визначити послідовність геному, кілька сантиметрів нитки ДНК хромосоми потрібно розбити на багато коротких фрагментів ДНК, а потім одночасно секвенировать тисячі таких фрагментів.
У 1970-х Фредерік Сангер та його колеги винайшли метод, за допомогою якого ДНК може бути секвенувана за допомогою хімічно модифікованих нуклеотидів. Спочатку ці нуклеотиди були розроблені, щоб зупинити поділ ракових клітин. Цей метод (або його варіант) був використаний для визначення першої послідовності геному людини та кількох модельних організмів. Однак за сучасними мірками метод є відносно повільним, дорогим і трудомістким. У першому десятилітті нового тисячоліття були розроблені більш швидкі та дешеві методи, які часто називають Висока пропускна спроможність резюмує. Ці методи використовують мініатюризовану техніку, спочатку розроблену для електронної промисловості, та механізми реплікації ДНК, часто у поєднанні з Ланцюгова реакція полімерази (ПЛР).
Перехресне посилання
ПЛР може бути автоматизована; це важливий метод для секвенування невеликої кількості ДНК. Детально про ПЛР можна знайти в розділі 10.1007/978-3-662-58172-8_13 # Sec23.
Методи послідовності з високою пропускною здатністю, також зведені під цим терміном Послідовність наступного покоління (NGS), швидко вдосконалюються. Один із багатьох підходів викладений тут і показаний на рис. 17.1. Спочатку фрагменти ДНК готують до секвенування, зв’язуючи їх із твердим носієм та ампліфікуючи ДНК за допомогою ПЛР (рис. 17.1 а):
Велика молекула ДНК розпадається на короткі фрагменти приблизно по 100 п.н. кожен. Це можна зробити фізично, створивши механічні сили зсуву, які руйнують ДНК. Або використовуються ферменти, які гідролізують фосфодіефірні зв’язки між нуклеотидами в скелі ДНК через певні проміжки часу.
ДНК денатурується теплом, розриваючи водневі зв’язки, що утримують дві нитки разом. Потім кожен окремий ланцюг виступає в якості шаблону для синтезу нової, комплементарної ДНК.
Короткі синтетичні олігонуклеотиди прикріплені до кінців кожного фрагмента, і вони прикріплені до твердої носії.
Фрагменти ДНК ампліфікуються за допомогою ПЛР. Використовуються праймери, які доповнюють синтетичні олігонуклеотиди на кінцях окремих фрагментів ДНК. Оскільки до кожного положення приєднано близько 1000 копій ДНК, щойно додані нуклеотиди можна легко виявити під час етапів секвенування.